紫外线致皮肤成纤维细胞和角质形成细胞中的自噬研究

发布时间：2018-02-06 05:17

  本文关键词： 紫外线 皮肤成纤维细胞 角质形成细胞 自噬 凋亡　出处：《北京协和医学院》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：探讨中波紫外线(ultraviolet B, UVB)照射人皮肤成纤维细胞诱导的自噬对细胞凋亡活性的影响。通过单丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverine, MDC)染色和免疫荧光标记微管相关蛋白1轻链3(light chain3, LC3)的方法,确定不同剂量3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine3-MA)对自噬的抑制作用。UVB照射后立即使用0.5mmol/L3-MA孵育细胞4h作为自噬的抑制方法。Hoechst和碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色结合Annexin V-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)和PI标记细胞后流式细胞术作为凋亡的分析方法。0.5mmol/L3-MA能明显抑制人皮肤成纤维细胞自噬活性(饥饿诱导组自噬细胞阳性百分数为63.037%±5.876%,3-MA孵育后下降至34.425%±5.183%)。0.5mmol/L3-MA对细胞活性影响最小。50mJ/cm2照射剂量下3-MA孵育较未孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞增多；100mJ/cm2照射剂量下3-MA孵育较未孵育细胞强Hoechst和强PI双染细胞减少。在50mJ/cm2照射剂量下,抑制自噬的细胞的中晚期凋亡细胞百分比(10.933±0.839)较未抑制细胞(7.267±0.473)上升,两者之间差异具有统计学意义(t=5.197,P=0.05)；而在100mJ/cm2照射剂量下,抑制自噬的细胞的中晚期凋亡水平(7.100±0.781)较未抑制细胞(10.133±0.681)下降,两者之间差异具有统计学意义(t=6.286, P0.05)。UVB诱导的人皮肤成纤维细胞自噬在50mJ/cm2照射剂量下通过抑制凋亡对细胞起到保护作用,而在100mJ/cm2照射剂量下发生的较高水平白噬可能诱导了自噬性细胞死亡。 观察慢性紫外线损伤对小鼠皮肤角质形成细胞凋亡和自噬交互调控元件Bax、 Bcl-2、Beclin-1及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的调控效应。采用模拟日光的UV对实验小鼠进行照射,设立对照。照射从最小红斑量(UVB0.07J/cm2,长波紫外线(ultraviolet A, UVA)0.7J/cm2)开始,1次/d,每周增加0.5个红斑量,每周照射5天,共9周,UVB总剂量达9.45J/cm2, UVA总剂量达94.5J/cm2,应用免疫组化法分别对实验前后(W0和W9) Bax、Bcl-2、Beclin-1和Caspase-3的表达进行检测,表达强度以免疫反应强度分布指数(immunoreactivity intensity distribution index, IRIDI)表示。在损伤组,照光(?)(?) Beclin-1、Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达计分均值(范围)分别为0.30(0-2)、0.25(0-2)、0.35(0-2)、0.25(0-1),照光后计分分别为2.70(2-6)、3.30(2-9)、3.35(2-6)、0.25(0-1)。损伤组小鼠表皮角质形成细胞中Beclin-1、Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高,且差异有统计学意义(P均0.05),Bcl-2蛋白表达变化不明显,且无统计学意义(P0.05)。损伤组W9时Beclin-1和Bax的表达明显高于Bcl-2(P均0.05)。在同时期正常饲养小鼠Beclin-1、Caspase-3. Bax、Bcl-2的均值(范围)在W0为0.20(0-1)、0.20(0-1)、0.30(0-1)、0.20(0-1),W9则为0.30(0-1)、0.20(0-1)、0.30(0-1)、0.10(0-1)。分析发现Beclin-1、Caspase-3、Bax、Bcl-2表达无统计学意义上的表达差异(P0.05)。慢性UV损伤对小鼠皮肤角质形成细胞中凋亡和自噬的交互调控元件Beclin-1和Bax具有上调表达的作用,而对另一元件Bcl-2表达调控效应不显著。这一系列的调控效应可能参与了凋亡和自噬在慢性UV皮肤损伤中的交互调控。 研究UVB照射对体外培养的HaCaT细胞自噬的调控效应。使用由低到高三种剂量照射HaCaT细胞后继续培养4小时,使用透射电镜进行细胞超微结构分析,并使用蛋白免疫印迹方法进行LC3-Ⅰ→Ⅱ型转换分析。结果发现小剂量和中等剂量的UVB照射后,细胞内可出现自噬体,并且在小剂量照射后更为多见；然而,当接受了高剂量照射后,细胞中不能发现此类的结构。小剂量UVB照射后,LC3-Ⅱ的蛋白表达量升高；中等剂量UVB照射对LC3-Ⅱ的蛋白表达量没有产生显著的变化；而高剂量的UVB照射产生了对LC3-Ⅱ的蛋白表达显著下调。研究结果提示小剂量UVB单次照射对角质形成细胞具有诱导自噬的效应,而高剂量的UVB单次照射产生了抑制自噬的效应。
[Abstract]:Study of ultraviolet (ultraviolet B, UVB) the effect of fiber cells induced by irradiation of human skin autophagy on cell apoptosis activity. Through single dansyl amyl amine two (Monodansylcadaverine, MDC) staining and immunofluorescence staining of microtubule associated protein 1 light chain 3 (light chain3 LC3) method to determine the different doses of 3- methyl adenine (3-methyladenine3-MA) on autophagy inhibition.UVB immediately after irradiation with 0.5mmol/L3-MA incubated 4H cells as the suppression method of autophagy of.Hoechst and propidium iodide (propidium iodide PI) Annexin V- staining with fluorescein isothiocyanate (fluorescein isothiocyanate, FITC) and PI labeled cells after flow cytometry as the analysis method of.0.5mmol/L3-MA apoptosis can inhibit human skin fibroblast activity (autophagy induced by starvation in percentage of positive cells was 63.037% + 5.876% group of autophagy, 3-MA decreased to 34.4 after incubation 25% + 5.183%).50mJ/cm2 minimum radiation dose of 3-MA for the effect of.0.5mmol/L3-MA on cell activity was less incubated with strong Hoechst and PI double staining cells increased; 100mJ/cm2 dose 3-MA incubation is incubated with strong Hoechst and strong PI staining in 50mJ/cm2 cells decreased. Irradiation dose, apoptosis the percentage of inhibition of autophagy cells (10.933 + 0.839) is not inhibited cell (7.267 + 0.473) increased, with a significant difference (t=5.197, P=0.05); and in the 100mJ/cm2 dose, in the late stage of apoptosis inhibiting autophagy cells (7.100 + 0.781) is not inhibited cell (10.133 + 0.681) decreased, with a significant difference (t=6.286, P0.05) of human skin.UVB induced autophagy into fiber cells by inhibiting apoptosis and protect the cells in the 50mJ/cm2 radiation dose, and 100mJ/cm2 irradiation High levels of white phagocytosis at a dose may induce autophagic cell death.
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本文编号：1493672