miRNA-340调节MITF分子参与UVB诱导色素合成的机制研究

发布时间：2018-03-04 16:44

本文选题：miRNA　切入点：UVB　出处：《中国人民解放军医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：人体肤色受多种因素影响,紫外线(ultraviolet,UV)照射为重要影响因素之一,其中,中波紫外线(ultravioletB, UVB)能使黑素细胞数目增多,细胞内酪氨酸酶活化,合成黑素小体功能增强,并促进黑素小体由黑素细胞向周围角质形成细胞转运。与UVB相关的色素沉着性皮肤病是皮肤科临床工作中的常见病,共同的临床特点是面颈部等曝光部位为主的色素沉着斑片或斑点,治疗棘手,病情迁延,严重影响患者的正常社交及生活质量。既往研究发现小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor, MITF)是调节黑素细胞色素合成的关键分子,可靶向调节二十余个基因的转录活性,包括调控黑素生成的基因、黑素小体转运基因、介导体内生理性黑素合成的神经内分泌信号的受体、黑素小体的结构蛋白等。近年来,microRNA (miRNA),因其能够对目的基因进行转录后水平的调控,影响细胞的多种生物学功能成为肿瘤及炎症性疾病研究领域的热点,它是一类长度约为22～25nt大小的单链非编码小分子RNA,可与靶向调控的信使RNA (messenger RNA, mRNA)相结合,促进其降解或抑制其蛋白翻译。课题组前期研究中发现UVB照射可引起永生化人表皮黑素细胞(Pig-1)miRNA表达谱发生变化,其中miRNA-340的表达变化具有时相性,即在UVB照射后3h表达增高,靶向结合黑素细胞树突生长的抑制因子RhoA,从而促进树突生长影响黑素代谢和转运。同时发现,miRNA-340在UVB照射后24h表达下降,通过生物信息学软件预测并查阅文献,发现MITF可能是miRNA-340的靶分子,由此我们推测人黑素细胞经UVB刺激后,miRNA-340可能靶向结合MITF分子的mRNA,诱导其降解并抑制其转录翻译过程,从而影响MITF相关信号通路的下游分子,如酪氨酸酶(Tyrosinase, TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1 (Tyrosinase related protein -1, TYRP-1)等,抑制黑素合成,成为治疗临床UVB相关色素沉着性皮肤病的新靶点。第一部分:UVB照射后miRNA-340变化趋势与黑素合成的相关性研究目的:通过研究UVB诱导后Pig-1细胞miRNA-340与色素合成相关分子MITF、TYR、TYRP-1的变化趋势关系,并对UVB处理后的Pig-1细胞进行色素测定,初步明确miRNA-340可能通过调节MITF参与UVB诱导的色素合成过程。方法:使用100mJ/cm2UVB处理Pig-1细胞,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative PCR,qRT-PCR)检测照射后0h、3h、6h、12h、16h、24h的实验组Pig-1细胞与未照射组的Pig-1细胞中miRNA-340的趋势差异表达,以及相同条件处理后Pig-1细胞中色素合成相关分子MITF、TYR、TYRP-1的mRNA变化趋势;应用蛋白免疫印迹法检测UVB照射后黑素合成相关分子MITF、TYR、TYRP1蛋白水平变化;使用氢氧化钠溶解法检测UVB照射后黑素含量变化趋势。结果:miRNA-340水平在照射后3h开始上升,6h达高峰,12h至24h持续下降。MITF水平在照射后3h上升,6h显著下降,于12h明显上升至16h达到顶峰,24h明显下降。TYR水平除24h组外,其余各组与对照组差异不具有统计学意义。TYRP-1照射后3h开始上升,16h达高峰,24h下降。MITF在蛋白水平于照射后16h表达最高。TYR各时间点蛋白表达量变化不显著。TYRP-1在照射后6h无显著变化,16h表达增高,24h表达水平明显下降。色素测定结果提示照射后6h色素含量开始持续上升,至24h时色素含量较未照射组增加1.4倍。结论:在人黑素细胞中,miRNA-340可能与MITF靶向结合并引起MITF的降解并抑制其表达,可能通过TYRP-1介导对UVB照射后黑素细胞的色素产生过程发挥调节作用。第二部分:miRNA-340调节MITF分子诱导UVB照射后黑素合成的作用机制研究目的:通过双荧光素酶报告基因检测验证miRNA-340与MITF的靶向结合关系,使用miRNA-340拟似物和抑制物感染Pig-1细胞后确认其对MITF在UVB照射后的调节作用,从而进一步明确miRNA-340通过调节MITF引起UVB诱导色素合成的科学推论,为临床治疗UVB相关色素沉着性疾病提供新思路与新靶点。方法:使用双荧光素酶报告基因检测(dual-luciferasereporterassay)验证miRNA-340与MITF的靶向结合关系。使用含miRNA-340拟似物(miRNA-340 mimic)和抑制物(miRNA-340inhibitor)的慢病毒感染Pig-1细胞,制备miRNA-340过表达及低表达的稳转细胞株。使用qRT-PCR方法验证UVB照射后miRNA-340稳转细胞株中与色素合成相关分子MITF、TYR、TYRP-1的趋势关系。使用蛋白免疫印迹法检测UVB照射后miRNA-340稳转细胞株与黑素合成相关分子MITF、TYR、TYRP-1蛋白表达变化。使用氢氧化钠溶解法检测UVB照射后miRNA-340过表达及低表达的稳转细胞株不同时相黑素含量变化。结果:使用荧光素酶报告基因检测发现共转染野生型MITF的3'UTR质粒和miRNA-340质粒后,荧光素酶表达活性较阴性对照组下降(约12%),两者比较,差异具有统计学意义。使用qRT-PCR分别检测miRNA-340拟似物(miRNA-340 mimic)、miRNA-340 抑制物(miRNA-340inhibitor)慢病毒感染 Pig-1 细胞内的miRNA-340水平,证明miRNA-340过表达与低表达稳转细胞系构建成功。UVB照射Pig-1细胞(NC)及miRNA-340inhibitor低表达稳转细胞,照射后16h发现MITF、TYR、TYRP-1表达量均上调。UVB照射Pig-1细胞(NC)、过表达及低表达miRNA-340的稳转细胞后24h测定色素发现,过表达miRNA-340稳转细胞组UVB照射后24h色素含量与NC组比显著降低,低表达组与NC组比色素含量显著增高。结论:miRNA-340靶向结合MITF的3'UTR特异性碱基抑制MITF表达并诱导其mRNA降解,同时可抑制色素合成通路的多个关键分子表达,下调UVB照射后黑素细胞产生色素的总量。综上提示miRNA-340可能成为临床治疗UVB相关色素沉着性疾病以及制备美白制剂的新靶点。
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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R751

【参考文献】