BF在毕赤酵母中的组成型分泌表达

发布时间：2016-11-01 11:15

  本文关键词：金环蛇抗菌肽Cath-BF在毕赤酵母中的组成型分泌表达，，由笔耕文化传播整理发布。

《广东药学院》 2015年

金环蛇抗菌肽Cath-BF在毕赤酵母中的组成型分泌表达

郝思怡  

【摘要】：痤疮是一种常见的毛囊皮脂腺炎症性皮肤病,主要由厌氧性座疮丙酸杆菌所致,目前主要采用抗生素治疗,但疗效不理想,并且可导致抗性菌的产生和超敏反应。新近从金环蛇蛇毒中分离的抗菌肽Cath-BF属于第一个被报道的脊椎动物来源抗菌肽,该抗菌肽可在小鼠模型中有效抑制痤疮丙酸杆菌及其它痤疮感染菌的生长,并抑制相关炎性增生,因此在痤疮防治中具有重要的应用价值。天然分离的Cath-BF为30个氨基酸残基组成的多肽,而根据其c DNA编码产物推断的该抗菌肽在N端应该还有4个氨基酸残基,即天然长度应该为34个氨基酸残基,,但目前尚未有实验证明该结构形式的抗菌肽是否存在及有无抑菌活性。蛇毒来源有限,从中制备抗菌肽得率低,成本高,化学合成抗菌肽同样存在成本高的问题,因此,采用基因工程手段建立高效生产方法对于Cath-BF的推广应用具有现实意义。毕赤酵母(Pichia pastoris)系统是最成熟的外源基因高效表达系统,遗传背景清楚、可高密度发酵,因而具有良好的工业化性能。其组成型表达系统是基于磷酸甘油醛脱氢酶的强启动子p GAP,无需像AOX1启动子那样采用甲醇诱导,用于人用产品的生产更安全。另外,Cath-BF作为小分子多肽,很难独立表达,分泌表达可以避免小肽被胞内蛋白酶降解,并且产物容易纯化。本研究采用毕赤酵母组成型分泌表达系统构建两种长度Cath-BF的高效表达工程菌,体外研究二种长度重组抗菌肽抑菌活性,并建立高效发酵工艺和分离纯化方法,为Cath-BF的进一步开发应用打下坚实基础。方法1.Cath-BF30与Cath-BF34目的基因合成采用毕赤酵母偏好密码子设计30肽与34肽Cath-BF的编码序列,首尾分别加上酶切位点、终止密码子等,采用引物重叠延伸PCR法(Overlap extension PCR)合成目的基因。2.Cath-BF30与Cath-BF34表达载体的构建以毕赤酵母系统p GAPZα载体为基础,目的片段与分泌信号肽MF-α融合后克隆于启动子GAP的下游,以便在葡萄糖做基础碳源的条件下组成型分泌表达N端为天然序列的抗菌肽。3.Cath-BF30与Cath-BF34毕赤酵母工程菌高效表达株的构建将目的基因表达载体质粒线性化后电转化蛋白酶缺陷型宿主毕赤酵母SMD1168细胞,筛选博来霉素高抗性转化子,取高抗性转化子培养上清进行丙酸杆菌抑菌斑筛选,选取上清抑菌活性强的转化子作为抗菌肽工程菌。4.Cath-BF30与Cath-BF34表达产物活性分析工程菌在摇瓶水平上培养,收集培养上清,96孔板法观察上清对痤疮丙酸杆菌厌氧培养物的生长抑制作用。5.培养基p H和发酵时间对Cath-BF30与Cath-BF34分泌水平的影响分别设立p H4.0,p H5.0,p H6.0和p H7.0等四种培养基,观察不同p H培养条件和培养时间下所获培养上清的抑菌活性。6.Cath-BF34毕赤酵母工程菌的发酵工程菌在最适p H和温度条件下于5L发酵罐中发酵,发酵周期为72h,收集发酵上清。7.Cath-BF34毕赤酵母工程菌发酵产物的纯化根据Cath-BF等电点为强碱性(p I=11.2)这一特性,采用强阳离子SP Sepharose FF柱将表达产物进行分离纯化。结果:1.成功克隆Cath-BF30与Cath-BF34编码序列,该序列基于毕赤酵母偏爱密码子设计,N端与分泌信号肽MFα下游无缝融合,可保证分泌产物为天然N端序列。2.获得了Cath-BF30与Cath-BF34的毕赤酵母高效分泌表达菌株,二者的分泌表达产物都具有抑制痤疮杆菌的活性。3.Cath-BF工程菌在培养基p H4.0条件下分泌水平最高,产物最稳定,当p H为5以上时培养上清抗菌活性低,且在培养后期几乎检测不到抗菌活性,表明需要在较低p H条件下培养才能有效抵抗宿主细胞蛋白酶的降解作用。4.Cath-BF工程菌在以葡萄糖做碳源的完全培养基中连续培养,并采取碳源控制手段时,可实现较高密度的生长和高效分泌表达,最终细胞密度达到160g/L(湿重)以上,抗菌肽分泌水平达到100mg/L以上。5.发酵上清经过SP Sepharose FF柱一步纯化可获得纯度95%以上的Cath-BF。结论:成功构建了金环蛇抗菌肽Cath-BF30与Cath-BF34的毕赤酵母高效组成型分泌表达系统和表达产物分离纯化方法,并实验证明了30肽和34肽的Cath-BF均具有座疮杆菌抑制活性。

【关键词】：
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R758.733
【目录】：

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