皮肤鳞状细胞癌puma基因外显子序列分析、mRNA水平和蛋白表达检测

发布时间：2018-03-20 08:00

  本文选题：puma　切入点：凋亡　出处：《昆明医科大学》2012年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的探讨皮肤鳞状细胞癌是否存在puma基因DNA序列、mRNA水平、蛋白质表达改变。 方法优化并最终确立了puma基因3个高GC含量外显子的扩增条件；采用实时荧光定量PCR的方法检测puma mRNA水平；进行Western blot险测PUMA蛋白的表达。 1.通过对实验条件的摸索,确立了puma基因3个外显子最终的扩增条件,分别如下： (1)Exon2的反应体系为2×Mastermix30μl上下游引物(10μmol/L)各1.5μl,模板DNA3.0μl,ddH2O24μl,总体积60μl；反应条件为95℃预变性5min,95℃45s、68℃45s、72℃45s,循环33次,最后72℃延伸5min。 (2) Exon3的反应体系各组分和Exon2相同；反应条件为95℃预变性5min,95℃45s、63℃45s、72℃45s,循环33次,最后72℃延伸5min。 (3) Exon4的反应体系各组分和Exon2相同；反应条件为95℃预变性5min,95℃45s、55℃45s、72℃45s,循环33次,最后72℃延伸5min。 2.通过对实验条件的摸索,建立实时荧光定量PCR检测puma mRNA的方法。实时荧光定量法检测puma mRNA的反应体系：2×SYBR premix10μl,上下游引物(10μmol/L)各0.4μl,ROX0.4μl,cDNA1.0gl,灭菌水7.8μl,总体系20μl。扩增条件：95℃预变性5min,95℃变性10s,60℃退火5s,72℃延伸10s,5个循环(不测荧光),95℃变性10s,60℃退火5s,72℃延伸10s,89℃延伸27s,40个循环(测荧光),终末65℃延伸5min。内参GAPDH扩增体系同上,扩增条件：95℃预变性5min,95℃变性15s,64℃退火5s,72℃延伸10s,5个循环(不测荧光),95℃变性15s,64℃退火5s,72℃延伸10s,78℃3s,72℃延伸30s,40个循环(测荧光),终末65℃延伸5min。(注：应用于绘制标准曲线的质粒为本课题前期试验细菌保种的TA克隆方法构建的pMD18-T(+)/puma和pMD18-T(+)/GAPDH重组质粒) 3.用Western Blot的方法检测PUMA蛋白的表达,采用B-actin作为内参基因。 结果 1.应用优化的扩增体系和条件对32例皮肤鳞状细胞癌组织的puma基因Exon2^3、4进行了PCR扩增,扩增产物测序后经Blast2序列比对分析,未发现任何突变。 2.采用实时荧光定量方法检测puma mRNA水平,puma mRNA在鳞癌组织和正常对照组中均有表达,但puma mRNA水平在皮肤鳞癌组织和正常皮肤对照组织的差异没有统计学意义(P0.05)。 3.用Western Blot的方法检测PUMA蛋白的表达,采用?-actin作为内参基因,32例皮肤鳞癌组织和2例正常皮肤对照的内参基因均表达,但只有8例皮肤鳞癌组织和1例正常对照表达PUMA,且表达量都相对较低。 结论 1. puma基因Exon2、3、4的编码序列保守且稳定。 2. puma mRNA的相对水平在皮肤磷癌组织和正常组织中的差异没有统计学意义。 3. PUMA蛋白在皮肤组织的表达相对较低。
[Abstract]:Objective to investigate the expression of puma DNA sequence and protein in cutaneous squamous cell carcinoma (SCC). Methods the amplification conditions of three exons with high GC content of puma gene were optimized and finally established, the puma mRNA level was detected by real-time fluorescence quantitative PCR, and the expression of PUMA protein was detected by Western blot. 1. By exploring the experimental conditions, the final amplification conditions of three exons of puma gene were established, which were as follows:. The reaction system was 2 脳 Mastermix30 渭 l primer 10 渭 mol / L, template DNA3.0 渭 lddH _ 2O 24 渭 l, total volume 60 渭 l.The reaction conditions were: predenaturation at 95 鈩，

本文编号：1638183