10培养HaCaT细胞和银屑病皮损的特点

发布时间：2016-11-05 12:42

  本文关键词：IFN-γ或IP-10培养HaCaT细胞和银屑病皮损的特点，由笔耕文化传播整理发布。

《郑州大学》 2013年

IFN-γ或IP-10培养HaCaT细胞和银屑病皮损的特点

张利勤  

【摘要】：银屑病是一种临床常见的、原因不明的慢性炎症性皮肤病。其发生、发展过程是需要多种趋化因子的共同参与,与遗传的内因和外环境的感染,营养,精神状态等外因有关,属于患者较多自体免疫疾病,且易反复发作。目前研究认为,银屑病是与Thl型细胞相关的免疫紊乱性疾病。γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)诱导蛋白10(IP-10)是CXCL家族趋化因子之一,又名CXCL趋化因子配体10,是由IFN-γ所诱导产生的可趋化淋巴细胞等的分子量为10kDa蛋白质。P-10不仅具有强大的招募中性粒细胞等炎症细胞的功能,还能促进多种细胞释放炎症因子,亦可促进角质形成细胞增生,能作为趋化因子介导Thl型炎症反应。IP-10在银屑病患者的皮损中表达持续上调,经过成功治疗后IP-10表达减少。IP-10可促进银屑病皮损的发生及发展。银屑病的发病与IFN-γ有重要关系,在银屑病患者的血清及角质形成细胞培养上清中IFN-γ浓度均明显高于正常人。在皮肤免疫中IFN-γ对角质形成细胞的增生与凋亡有重要影响,它促进角质形成细胞增生,IFN-γ在角质形成细胞的增殖中发挥关键作用。 近年研究发现各种疾病既与基因学,也与表观遗传学的改变有关。表观遗传学调控机制在自身免疫性疾病及肿瘤的发展中起到重要的作用,表观遗传学参与了银屑病发病机制,具体在银屑病的发病机制中尚不十分清楚。表观遗传学主要包括基因的DNA甲基化；组蛋白的修饰以及小分子RNA调控。表观遗传学的改变,虽不改变ATCG的序列,却影响基因的转录,增殖,分化,凋亡等细胞过程。HaCaT细胞为永生化角质形成细胞,为研究抗银屑病药物活性的常用细胞株。本实验研究通过应用IP-10与IFN-γ分别诱导人HaCaT角质形成细胞,观察作用后对HaCaT角质形成细胞表观遗传学的改变以及对增殖与炎症的影响,并与银屑病患者皮损组织的病变特征作对比。初步揭示了IP-10与IFN-γ对于人HaCaT角质形成细胞的作用,模拟了银屑病的皮损组织特点,探讨IP-10/IFN-γ对银屑病发生和发展中的作用。 目的 1.观察IP-10与IFN-γ分别对HaCaT角质形成细胞的表观遗传学的改变及对增殖与炎症的影响。 2.银屑病患者皮损组织与正常组织作对比,探讨银屑病表观遗传学的改变,对增殖与炎症因子的变化。IP-10与IFN-γ分别对HaCaT的特点与银屑病皮损相比较,说明IP-10/IFN-γ对银屑病发生和发展中的作用。 材料与方法： 临床资料 收集我院2011年10月至2012年4月皮肤门诊寻常性银屑病患者皮损20例,均经组织病理学确诊。以及收集我院2012年1月至2月泌尿外科包皮切除患者20例。本研究经我院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。 角质形成细胞HaCaT株冻存于郑州大学医学院分子细胞生物学研究中心 方法 实验标本分为细胞与组织两大组 1)细胞：IP-10(20ng/ml)组；IFN-γ (50u/L)组及对照(C)组 2)组织：银屑病皮损组和正常对照组 1.免疫印迹 1)细胞 应用CelLyticTM提取蛋白质,考马斯亮蓝G-250检测蛋白浓度并进行SDS-PAGE电泳,转膜,对DNMT1, NF-κBp65, HDAC1, Cyclin D1, IL-6及P16(以β-actin作为内参照)进行免疫印迹定性及半定量检测。 1)组织 用匀浆器将组织研碎,应用CelLyticTM提取蛋白质,考马斯亮蓝G-250检测蛋白浓度并进行SDS-PAGE电泳,转膜,对DNMT1, NF-κBp65, HDAC1, Cyclin D1,IL-6及P16(以β-actin作为内参照)进行免疫印迹定性及半定量检测。 2.免疫化学染色 1)细胞 各标本经4%多聚甲醛中固定,吹干及透化,应用SP试剂盒,检测NF-κB及IL-6的表达。同时进行以PBS替代一抗的阴性对照。 2)组织 各组织标本经4%多聚甲醛中固定,按常规脱水、透明并行石蜡包埋切片。在石蜡入水过程中,用0.3%H202处理以抑制内源性过氧化物酶(HRP),用5mM左旋咪唑处理以抑制外源性碱性磷酸酶(AP)后,应用NF-κB鼠单抗,IL-6兔多抗对皮损组及正常对照组进行以NF-κB, IL-6以AEC酶为底物的免疫组织化学染色。正常血清封闭,,4℃孵育过夜,先进行AEC染色后,再进行多抗的NBT-BCIP染色,DAB显色并终止。同时进行以PBS替代一抗的阴性对照。 3.MSP甲基化特异PCR应用TIANamp Genomic DNA Kit进行各细胞及组织标本的基因组DNA的提取。然后应用MethylampTM DNA Modification Kit进行各基因组DNA甲基化。甲基化特异的p16基因引物及未甲基化特异性的p16基因引物进行PCR反应扩增。DNA电泳检测目的产物。 4.统计学分析 采用SPSS17.0软件进行统计学分析。应用图像分析仪扫描各图像的条带灰度,各细胞与组织化学染色及MSP条带的信号值,各免疫印迹数值为各主带扫描灰度均值与其各β-actin扫描灰度均值的比值。正态分布的数据以均数±标准差(x±S)表示,以单因素方差进行分析比较,a=0.05为显著性水准。 结果 1.免疫印迹 1)细胞 与对照组相比,DNMT1(180kDa), NF-κBP65(65kDa), HDAC1(60kDa), CyclinD1(36kDa), IL-6(23kDa)及P16(16kDa)的免疫信号。IP-10组、IFN-γ组差异均有统计学意义(P0.05)。 2)组织 与对照组相比,DNMT1(180kDa), NF-κBp65(65kDa), HDAC1(60kDa), CyclinD1(36kDa), IL-6(23kDa)及P16(16kDa)的免疫信号。银屑病患者皮损组差异有统计学意义(P0.05)。 2.免疫染色 1)细胞 与对照组相比,IP-I0组的NF-κB和IL-6胞核阳性表达均增强,差异显著(P0.01)。IFN-γ组的NF-κB和IL-6胞核阳性表达均增强,差异有统计学意义(P0.05)。 2)组织 与正常组织相比,皮损组织表皮增殖旺盛,棘细胞体积增大,层次增多,可见胞核呈阳性信号；皮损组NF-κB与IL-6的表达明显高于正常组(P0.01)。 3.MSP 1)细胞 与对照组相比,IP-10组、IFN-γ组的甲基化P16表达较高,非甲基化P16表达较低,差异具有显著性P0.05)。 2)组织 与正常组织相比,银屑病皮损组织甲基化P16表达较高,非甲基化P16表达较低,差异具有显著性P0.05)。 结论 1.免疫印迹显示DNMT1和HDAC1在IP-10/IFN-γ细胞组和皮损组织的表达均高于相应对照组,提示IP-10/IFN-γ细胞组和皮损组织皆可能存在表观遗传学的改变。 2. IP-10/IFN-γ细胞组与银屑病皮损组织中,Cyclin D1, NF-κBp65和IL-6的免疫印迹及免疫染色的表达均显著增高,并且P16免疫印迹信号下调,提示IP-10/IFN-γ诱导了细胞的增殖与炎症反应。 3.MSP显示IP-10/IFN-γ细胞组与银屑病皮损组织中的P16甲基化水平皆高于相应对照组,而非甲基化则明显下降,低于甲基化。 4.IP-10与IFN-γ通过表观遗传学的改变,显著提高HaCaT细胞的增殖及炎症因子,此与银屑病皮损组织特点类似。提示IP-10与IFN-γ参与了银屑病的发生机制与发展,可得出以IP-10/IFN-γ培养的HaCaT细胞模拟了银屑病的特点。

【关键词】：
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R758.63
【目录】：

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本文编号：165223