HSulf-1基因在银屑病及HaCaT细胞中的表达和过表达慢病毒载体的构建

发布时间：2018-03-30 06:49

本文选题：银屑病　切入点：HSulf-1　出处：《安徽医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：背景银屑病是一种与免疫、炎症、细胞增殖与凋亡、微血管生成等多种因素相关的慢性复发性疾病,确切发病机制不明。组织病理学上的主要特征有角质形成细胞过度增殖和血管生成。目前研究表明缺氧与银屑病发病相关。银屑病的角质形成细胞增殖可能导致耗氧量的增加,而表皮的增厚也能促使氧的弥散距离增加,氧气供应减少,出现局部缺氧。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)为缺氧微环境中的关键性因子,已知其参与银屑病的发生发展,在银屑病及人永生化角质形成细胞(Ha Ca T细胞)中高表达。人硫酸酯酶-1(HSulf-1)是近年来发现的新型肿瘤抑制基因,存在于细胞表面,在正常组织中恒定表达,而在多数恶性肿瘤中表达下降或缺失,其再表达可导致肿瘤细胞增殖、迁移或侵袭的能力相对减弱。有报道HSulf-1为HIF-1α的下游靶基因,HSulf-1转录起始上游的启动子端存在可与HIF-1α结合的缺氧反应元件(HRE)位点,缺氧可能导致HSulf-1异常活化降低,从而引起下游信号通路、细胞侵袭和转移的改变。基于银屑病与恶性肿瘤都具有特征性局部缺氧和细胞增殖的特点,我们推测HSulf-1可能在银屑病发生发展中发挥一定作用,本课题旨在研究HSulf-1和HIF-1α在银屑病皮损区与正常皮肤中的表达水平以及在常氧和缺氧时人永生化角质形成细胞株Ha Ca T细胞中的表达情况,并构建HSulf-1基因的过表达载体便于后续进一步体内外研究其与角质形成细胞增殖的关系。目的探讨HSulf-1、HIF-1α在银屑病皮损区与正常皮肤中的表达以及常氧和缺氧时人永生化角质形成细胞株Ha Ca T细胞中的表达,构建HSulf-1基因过表达载体便于后续进一步体内外研究其与角质形成细胞增殖的关系。方法第一部分:(1)分别应用HSulf-1、HIF-1α抗体对银屑病皮损组织及正常人皮肤组织进行免疫组织化学染色检测,高倍镜下观察阳性细胞的数量。(2)Ha Ca T细胞培养后,分别加入不同浓度(浓度分别为0μmol/L、100μmol/L、300μmol/L、600μmol/L)处理的二氯化钴(Co Cl2)处理24小时,收集总蛋白后行Western blotting检测不同缺氧浓度下Ha Ca T细胞中HSulf-1、HIF-1α蛋白的表达情况。第二部分:构建重组质粒p CDH-HSulf-1,Western blotting法筛选HSulf-1过表达稳转Ha Ca T细胞株。结果第一部分:(1)HSulf-1在银屑病皮损区低表达,在正常组织中高表达。HIF-1α在银屑病皮损区高表达,在正常组织中低表达。(2)相对于常氧,HIF-1α蛋白在缺氧条件下高表达,而HSulf-1蛋白在缺氧条件下低表达,二者表达呈负相关。第二部分:(1)经Nhel I和Bam HI双酶切PCR鉴定和DNA测序显示,成功构建p CDH-HSulf-1重组质粒;(2)对p CDH-HSulf-1进行慢病毒包装,出现绿色GFP荧光;(3)HSulf-1过表达组与对照组及空白组相比,HSulf-1过表达组的HSulf-1蛋白的表达水平显著提高(P0.05),成功筛选过表达的稳转细胞株。结论HSulf-1在银屑病皮损区低表达,在正常组织中高表达;缺氧下HSulf-1在Ha Ca T细胞中低表达,这都与其在肿瘤细胞或肿瘤组织中表达一致,因其过表达可抑制肿瘤细胞增殖。我们推测过表达HSulf-1可能抑制角质形成细胞的增殖。构建HSulf-1基因过表达载体,成功筛选过表达Ha Ca T稳定细胞株,便于进一步体内外研究其与角质形成细胞增殖的关系。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R758.63

【参考文献】