皮肤基底细胞癌中puma基因外显子序列分析和mRNA表达

发布时间：2018-04-01 03:30

  本文选题：puma　切入点：凋亡　出处：《昆明医学院》2011年硕士论文

【摘要】：目的探讨puma(p53 up-regulated modulator of apoptosis)基因突变、mRNA表达与皮肤基底细胞癌的相关性。 方法通过对实验条件的探讨,优化并最终确立了puma基因三个高GC含量外显子的扩增条件；建立了实时荧光定量RT-qPCR检测puma mRNA的表达情况的方法。 结果 1.通过对实验条件的摸索,确立了puma基因三个外显子的最终扩增条件,分别如下： (1)外显子2(Exon2)的反应体系：2×Mastermix 25μl,上下游引物(10μmol/L)各1.25μl,模板DNA 2.5μl, ddH2O 20μl,总体积50μL。反应条件为95℃预变性5min,95℃45sec、70℃45sec、72℃45sec,循环33次,最后72℃延伸5min。 (2)外显子3(Exon3)的反应体系：上下游引物(10μmol/L)各1.3μl,模板DNA2.5μl, ddH2O 19.9μl,其余组分和外显子2相同。反应条件为95℃预变性5min,95℃45sec、66℃45sec、72℃45sec,循环33次,最后72℃延伸5min。 (3)外显子4(Exon4)的反应体系：上下游引物(10μmol/L)各0.9μl,模板DNA2.5μl, ddH2O 20.7μl,其余组分和外显子2相同。反应条件为95℃预变性5min,95℃45sec、59℃45sec、72℃45sec,循环33次,最后72℃延伸5min。 2.应用优化后的扩增体系和条件对24例面部皮肤基底细胞癌组织以及7例面部正常组织的puma基因外显子2～4进行了PCR扩增,扩增产物经测序检测是否有突变,经Blast 2序列比对分析,未发现任何突变。 3.通过T载体克隆方法成功构建pMD18-T(+)/puma和pMD18-T(+)/GAPDH重组质粒,并通过对实验条件的摸索,建立实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测puma mRNA的方法。实时荧光定量法检测puma mRNA的反应体系：2×SYBR premix 10μl,上下游引物(10μmol/L)各0.4μl,ROX 0.4μl,cDNA 1.0μl,灭菌水7.8μl,总体系20μl。扩增条件：95℃预变性5 min,95℃变性10 sec,60℃退火5 sec,72℃延伸10 sec,5个循环(不测荧光),95℃变性10 sec,60℃退火5sec,72℃延伸10 sec,78℃2 sec,72℃延伸30 sec,40个循环(测荧光),终末65℃延伸5 min。内参GAPDH体系同上,扩增条件：95℃预变性5 min,95℃变性15 sec,64℃退火5 sec,72℃延伸10 sec,5个循环,95℃变性15 sec,64℃退火5 sec,72℃延伸10 sec,78℃3 sec,72℃延伸30 sec,40个循环(测荧光),终末65℃延伸5 min。 4.采用校正曲线法检测puma mRNA的相对表达量,puma mRNA在癌组织和正常对照组中均有表达,puma mRNA表达量在基底细胞癌组织和正常对照组织的表达量差别有统计学意义,癌组织puma mRNA表达量低于正常组织(P0.05)。 结论 1.puma基因外显子2～4的编码序列保守且稳定。 2.puma mRNA的相对表达量在基底细胞癌组织和正常组织中存在差异,且在基底细胞癌组织中的相对表达量低于正常组织。
[Abstract]:Objective to investigate the relationship between the expression of puma(p53 up-regulated modulator of apoptosismRNA and basal cell carcinoma of skin. Methods the conditions for amplification of three exons with high GC content of puma gene were optimized and finally established, and a real-time fluorescent quantitative RT-qPCR method for detecting the expression of puma mRNA was established. Results. 1. The final amplification conditions of three exons of puma gene were established by exploring the experimental conditions, which were as follows:. The reaction system was: 2 脳 Mastermix 25 渭 l, 10 渭 mol / L of upstream and downstream primer, 2.5 渭 l of template DNA, 20 渭 l of ddH2O, and 50 渭 L of total volume. The reaction conditions were as follows: predenaturation at 95 鈩，

本文编号：1693782