溶解性转糖酶C（LtgC）功能部位对淋球菌生长的影响

发布时间：2018-05-06 06:44

  本文选题：淋病奈瑟菌 + 肽聚糖　； 参考：《吉林大学》2010年博士论文

【摘要】： 淋病是由淋球菌引起的泌尿生殖系统的化脓性感染,严重危害着人类的健康。临床上主要采用抗生素治疗,近年来因抗生素的滥用和乱用,耐药菌株大量出现,急需调整抗生素用药策略和研发新型的抗淋球菌药物和药物作用靶点。溶解性转糖酶C(LtgC)通过催化切割肽聚糖β-1,4糖苷键断裂,在淋球菌分裂和生长中发挥重要作用,可能是潜在的药物作用靶点。本实验采用分子克隆和同源重组技术研究溶解性转糖酶C的活性位点和特异的结构域三对淋球菌生长分裂的影响,阐述作用机制,为研发新型抗淋球菌药物提供一定的理论和实践依据。 采用分子生物学方法获得淋球菌FA19ltgC敲除株(FA19△ltgC)、D393A突变株(FA19ltgC_(D393A))、D405A突变株(FA19ltgC_(D405A))和结构域三缺失株(FA19ltgC_(△DM3))和结构域三表面七个氨基酸突变株(FA19ltgC_(7M))。野生型淋球菌FA19菌落表面光滑且明亮、无褶皱、边缘完整;但FA19△ltgC的菌落表面出现褶皱和凸凹不平,菌体生长缓慢,四小时停止生长;且FA19ltgC基因的遗传修复株(FA19 ltgC-com)可回复为FA19的表型,上述结果表明LtgC是淋球菌内重要的、保守的功能性蛋白,该蛋白的缺失导致淋球菌细胞分裂不完全,生长缓慢。FA19ltgC_(D393A)和FA19ltgC_(D405A)菌落表型和FA19△ltgC菌落表型一致。FA19ltgC_(D393A)、FA19ltgC_(D405A)和FA19△ltgC细胞生长速度相近,均比FA19野生株生长缓慢,该结果暗示393位和405位的天冬氨酸共同作用切割肽聚糖糖苷键断裂。 本实验采用分子克隆技术敲除LtgC结构域三163-244位氨基酸,以及用氨基酸RGR替换LtgC的167-244位氨基酸,重组表达纯化获得两个LtgC结构域三突变体蛋白(LtgC_(△163-244)和LtgC_(△167RGR244)). LtgC_(△163-244)突变体蛋白在大肠杆菌体内没有表达,但LtgC_(△167RGR244)蛋白表达量高且可溶性良好。将LtgC_(△167RGR244)基因同源重组到淋球菌基因组,获得LtgC结构域三缺失株(FA19ltgC_(△DM3)). FA19ltgC_(△DM3)的表型和FA19△ltgC表型相似,生长速度缓慢。但FA19ltgC_(7M)的表型和野生型未见显著性差异。该结果表明,结构域三是LtgC帮助淋球菌生长的关键结构区域,但不是其他蛋白结合位点。 大肠杆菌溶解性转糖酶A( MltA)和淋球菌LtgC是同源蛋白,在结构和功能方面有很多相似性.分别用mltA和ltgC基因对ltgC缺失株进行遗传修复,发现ltgC和MltA的互补株完全回复淋球菌野生株的表型,而且MltA对淋球菌生长的促进作用比LtgC更强.在检测MltA对淋球菌肽聚糖的切割作用时,观察到MltA酶切活性受到淋球菌高度乙酰化的肽聚糖的抑制,但可溶表达的LtgC蛋白切割未见酶切肽聚糖活性。 在LtgC的N端加入19个氨基酸的脂蛋白后, LtgC蛋白在E.coli Bl21中表达量很低,可能该脂蛋白对E.coli产生毒性作用使表达受到抑制,暗示LtgC蛋白需要脂蛋白序列协助发挥作用;携带脂蛋白序列的LtgC_(D393A)和LtgC_(D405A)突变株蛋白在大肠杆菌中表达量和LtgC可溶蛋白表达量相近,说明Asp393和Asp405位点突变抑制LtgC对大肠杆菌的毒性作用;但结构域三表面的七重氨基酸突变体蛋白表达量仍然很低,证明结构域三可能不是其他协同作用蛋白和LtgC的结合部位。 综上所述,本研究证实LtgC是淋球菌生长和分裂的重要功能性酶,首次证明Asp393和Asp405是LtgC影响淋球菌生长的重要功能部位;结构域三的缺失抑制淋球菌细胞分裂,但它不是多酶复合体的结合位点;首次发现MltA可修复由LtgC缺失引起的淋球菌表型变化,并促进淋球菌生长;无脂蛋白序列的LtgC无酶切活性,表明脂蛋白序列是LtgC的重要结构。首次鉴定MltA体外活性受到淋球菌肽聚糖乙酰化抑制,可能与淋球菌避免自溶有关。本论文初步证明LtgC可能是潜在的淋球菌药物作用靶点,尤其是LtgC的Asp393和Asp405可视为筛选抑制剂的潜在靶标,为研发新型抗淋球菌药物提供一定的理论依据。
[Abstract]:Gonorrhea is a purulent infection of the genitourinary system caused by Neisseria gonorrhoeae, which seriously endangers human health. The main clinical use of antibiotics is the use of antibiotics. In recent years, the drug abuse and disorderly use of antibiotics, a large number of drug-resistant strains appear, the urgent need to adjust the strategy of antibiotics and the research and development of new type of drug and drug target. Sexual trans glucoenzyme C (LtgC) breaks through the catalytic cutting of peptidoglycan beta -1,4 glycoside bonds and plays an important role in the division and growth of gonococci. It may be a potential target for drug action. The effect of molecular cloning and homologous recombination on the active site of soluble trans glucoenzyme C and the specific domain three on the growth and division of gonococci To explain the mechanism of action and provide theoretical and practical basis for the development of new anti gonococcal drugs.
FA19ltgC knockout strain (FA19 Delta ltgC), D393A mutant (FA19ltgC_ (D393A)), D405A mutant (FA19ltgC_ (D405A)), three deletion strains (FA19ltgC_ (DM3)) and seven amino acid mutant strains (FA19ltgC_) on the three surface of the domain of the domain were obtained by molecular biological methods. Wrinkle and complete edge; but the colony surface of FA19 Delta ltgC appears wrinkle and convex concave, the growth of the bacteria is slow, and the growth is stopped for four hours. And the genetic repair strain of FA19ltgC gene (FA19 ltgC-com) can revert to the phenotype of FA19. The above results indicate that LtgC is an important and conservative functional protein in gonococcus, and the loss of the protein leads to gonococcus fineness .FA19ltgC_ (D393A) and FA19ltgC_ (D405A) colony phenotype and FA19 Delta ltgC colony phenotype are consistent with.FA19ltgC_ (D393A). FA19ltgC_ (D405A) and FA19 Delta ltgC cells are similar in growth speed, and are slower than those of wild plants. The results suggest that 393 and 405 aspartic acids combine to cut peptidoglycan bonds. Crack.
In this experiment, the molecular cloning technique was used to knock out three 163-244 amino acids in the LtgC domain, and the amino acid RGR was used to replace 167-244 amino acids of LtgC. The recombinant expression was purified to obtain two LtgC domain three mutant proteins (LtgC_ (delta 163-244) and LtgC_ (delta 167RGR244)). The mutant protein of LtgC_ (delta 163-244) was not expressed in Escherichia coli. However, the expression of LtgC_ (delta 167RGR244) protein was high and soluble. The homologous LtgC_ (delta 167RGR244) gene was reorganized into the genome of gonococcus, and the phenotype of LtgC (delta DM3) was obtained. The phenotype of FA19ltgC_ (delta DM3) was similar to FA19 Delta ltgC, and the growth rate was slow. However, the phenotype and the wild type of the FA19ltgC_ (LtgC_) were not significant. The results indicate that domain three is a key structural area for LtgC to help Neisseria gonorrhoeae growth, but not other protein binding sites.
Escherichia coli lysis A (MltA) and gonococcal LtgC are homologous proteins. There are many similarities in structure and function. MltA and ltgC genes are used to repair ltgC missing strains, respectively. It is found that the complementary strains of ltgC and MltA fully respond to the phenotype of gonococcal wild strains, and MltA has a stronger effect on gonococcal growth than LtgC. When detecting MltA's cutting effect on gonococcal peptidoglycan, it was observed that the activity of MltA enzyme cutting was inhibited by the highly acetylated peptidoglycan, but the soluble expression of LtgC protein had no enzyme cut peptidoglycan activity.
After adding 19 amino acid lipoproteins at the N end of LtgC, the expression of LtgC protein in E.coli Bl21 is very low. It is possible that the lipoprotein has a toxic effect on E.coli, which inhibits the expression, suggesting that the LtgC protein needs the lipoprotein sequence to help to play a role; the LtgC_ (D393A) and LtgC_ (D405A) mutant protein carrying the lipoprotein sequence in the Escherichia coli The expression amount was similar to that of LtgC soluble protein, indicating that the mutation of Asp393 and Asp405 loci inhibited the toxic effect of LtgC on Escherichia coli, but the expression of the seven heavy amino acid mutant protein on the three surface of the domain was still very low, which proved that the domain three might not be the binding site of other synergistic egg white and LtgC.
To sum up, this study confirmed that LtgC is an important functional enzyme for the growth and division of gonococcus. It is the first time that Asp393 and Asp405 are important functional parts of LtgC that affect the growth of gonococcus; the deletion of the domain three inhibits the cell division of Neisseria gonorrhoeae, but it is not a binding site of the multi enzyme complex; it is the first time that MltA can be repaired by LtgC deletion. The phenotypic change of gonococcus and the growth of gonococcus, the LtgC without lipoprotein sequence showed that the lipoprotein sequence was an important structure of LtgC. It was first identified that the activity of MltA in vitro was inhibited by Neisseria gonorrhoeae acetylation, which may be related to the avoidance of Neisseria gonorrhoeae autolysis. This paper preliminarily proved that LtgC may be a potential drug for gonococcal drugs. Targeting targets, especially Asp393 and Asp405 of LtgC, can be regarded as potential targets for screening inhibitors, providing a theoretical basis for the development of new anti gonococcal drugs.

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R759.2

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本文编号：1851256