《第二军医大学》2013年硕士论文

发布时间：2016-11-24 19:03

  本文关键词：转K14-VEGF基因鼠的实验模型构建，由笔耕文化传播整理发布。

《第二军医大学》 2013年

转K14-VEGF基因鼠的实验模型构建

李红  

【摘要】：银屑病是种全球常见的皮肤病，发病率占世界人口的0.1%～3%。该病是由T细胞介导的自体免疫性疾病，由90年代初期确立的T细胞在银屑病发病中的核心作用至今仍未改变。在机体免疫应答反应中，Th属于适应性免疫系统，Th1分泌干扰素γ(IFN-γ)、IL-2和TNF-等，Thl7则分泌IL-17和IL-22等细胞因子，这些细胞因子单独或者协同作用，引起银屑病的病理改变，因此目前银屑病被界定为Thl／Thl7共同介导的免疫紊乱。此外，T细胞释放的细胞因子刺激角质形成细胞（KC）异常增殖、分化，伴随表皮过度增殖、角化不全、真皮慢性炎症等反应，临床表现为界限清楚的红斑和鳞屑。银屑病发病机制尚未阐明，发病群体仅限于人类或与人类亲缘关系较近的灵长类动物，目前，研究其发病机制常利用动物模型产生类似银屑病的症状进行研究，然而没有种动物模型能表现该病的全部病理特征。目前，些由于自身基因缺失导致的突变鼠或者利用转基因技术制备的动物模型产生了与人类银屑病临床表现相似的症状，例如表皮增厚、炎症细胞浸润、血管增生等。 VEGF在正常机体的血管发育中具有重要的作用，是诱导血管生成的各种细胞因子中最强的血管通透因子。在银屑病发病过程中VEGF通过与其内皮细胞上的特异性受体结合从而发挥促进毛细血管增殖、诱导毛细血管增生、促进内皮细胞分裂、增殖和抑制凋亡等多种功能。同时VEGF对炎症介质和血管内皮细胞化学趋化作用，能够加重银屑病皮损处的炎症反应，促进银银屑病的病理过程。VEGF转基因鼠最早是由Michael Detmar研制而成，由角蛋白14（K14）启动子控制小鼠VEGF-A164在小鼠皮肤的表达。本研究依据国外公开报道资料及国内现有条件，进行转K14-VEGFA164基因鼠模型的构建。 首先采用gateway克隆技术与基因重组的方法构建重组质粒pRP.EX3d-K14mVEGF164hGH，然后双酶切重组质粒得到转基因片段，经体外鉴定后，回收包含人K14启动子和鼠编码基因VEGF-A164大片段，并将回收的片段插入到FVB鼠受精卵的雄原核中(较大的原核)，注入特定的外源基因，成功构建转基因首建鼠。 采用显微注射方法制备的转基因鼠的基因的插入位点具有随机性，转基因鼠需要 个相当长的筛选、纯化过程。在对转基因鼠纯化时，需筛选出VEGF表达较高的谱系，般情况下，不同谱系的转基因鼠的同龄子代鼠经PCR方法进行鉴定后，利用Real-time与Western-blot，筛选出了VEGF表达较高的谱系，然后采用经典育种与PCR相结合的方法对转基因鼠进行纯化，即同窝交配的原则，进而获得转基因鼠纯合子。 在转基因鼠的抚育过程中，随着转基因小鼠的生长，不同月龄的小鼠将产生不同的症状，3月龄左右时，小鼠皮肤内的肥大细胞数量明显多于同龄野生型，5～6月龄时，转基因鼠出现类似银屑病的皮肤炎症情况，真皮微血管增生，表皮渗透性增加，角蛋白细胞异常分化等现象。此外，对转基因鼠的后续研究发现，与银屑病致病相关的细胞因子如IL-6、 IL-17、STAT3、VEGF等在转基因鼠内的表达明显高于野生型。因此构建的K14-VEGF转基因鼠，K14启动子特异性的表达于扁平上皮细胞基底层并且控制转基因VEGF成分的表达。本课题依据，建立转K14-VEGF基因鼠模型，以期服务于国内相关研究。

【关键词】：
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R758.63
【目录】：

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  本文关键词：转K14-VEGF基因鼠的实验模型构建，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：191190