DKK1在黑素瘤中的表达及其对黑素瘤发生发展的调控的实验研究

发布时间：2018-10-11 19:32

【摘要】：第一部分DKK1和β-catenin在人黑素瘤中的表达及意义 目的 研究DKK1和β-catenin在人原位恶性黑素瘤组织、淋巴结转移恶性黑素瘤组织、正常人表皮组织中的表达,探讨DKK1在恶性黑素瘤发生发展中的作用及其与经典Wnt信号通路的相关性。 方法 应用免疫组织化学方法检测DKK1和β-catenin在人原位恶性黑素瘤组织、淋巴结转移恶性黑素瘤组织和正常人表皮组织中的表达。 结果 (1) DKK1在恶性黑素瘤组织中的表达低于正常人表皮组织。 (2) DKK1在淋巴结转移恶性黑素瘤组织中的表达低于原位恶性黑素瘤组织。 (3)β-catenin在恶性黑素瘤组织中的表达高于正常人表皮组织。 (4)β-catenin在淋巴结转移恶性黑素瘤中的表达高于原位恶性黑素瘤组织。 结论 (1) DKK1在正常人表皮中表达较高,而在恶性黑素瘤中的表达减少,从而推测DKK1在恶性黑素瘤的发生中起一定作用。 (2) DKK1在淋巴结转移恶性黑素瘤中的表达低于原位恶性黑素瘤,从而推测DKK1与恶性黑素瘤恶性程度呈负相关。 (3)β-catenin在恶性黑素瘤中表达较高,而在正常人表皮中的表达减少,推测DKK1可能通过调控β-catenin的表达,从而在恶性黑素瘤的发生中发挥作用。 (4)β-catenin在淋巴结转移恶性黑素瘤中的表达高于原位恶性黑素瘤,从而推测β-catenin与恶性黑素瘤恶性程度呈正相关。 第二部分Ad-DKK1重组腺病毒载体的构建 目的 构建高表达目的基因DKK1重组腺病毒质粒,转染包装细胞HEK293,得到高滴度的腺病毒感染液。 方法 通过同源重组的方法构建表达目的基因DKK1的腺病毒质粒,首先通过PCR的方法扩增含有接头的目的基因片断DKK1,定向克隆进入腺病毒穿梭质粒pAdtrack-TO4,再转入含有腺病毒骨架质粒Adeasy -1的感受态细菌BJ-Adeasy中,同源重组产生腺病毒质粒Ad-DKK1,最终进入包装细胞HEK293,经过乒乓交互感染收获高滴度病毒感染液。 结果 (1)重组质粒经限制性内切酶PacⅠ酶切鉴定,DNA电泳,结果Ad-DKK1显示:4.5kb大小的条带,与预期结果吻合,说明重组腺病毒Ad-DKK1构建成功。 (2)荧光显微镜下观察,Ad-DKK1腺病毒感染人黑素瘤细胞A375,大量细胞均可见绿色荧光。 (3)通过乒乓交互感染,收获高滴度的Ad-DKK1病毒感染液。 (4) RT-PCR检测DKK1 mRNA表达,感染了Ad-DKK1人黑素瘤细胞A375中DKK1 mRNA水平明显高于对照组(P0. 05)。 (5) Western-blot检测DKK1蛋白表达,感染了Ad-DKK1的人黑素瘤细胞A375中DKK1蛋白水平明显高于对照组(P0. 05)。 结论 (1)经酶切和测序鉴定,成功构建了高表达DKK1的Ad-DKK1的同源重组腺病毒。 (2)荧光显微镜下观察,稳定感染了Ad-DKK1腺病毒的A375可见大量绿色荧光。 (3)运用RT-PCR和Western-blot实验,验证了感染Ad-DKK1同源重组腺病毒的A375中DKK1的表达明显增高。 第三部分DKK1对人黑素瘤细胞生物学行为的影响 目的 差异表达DKK1后,研究其对A375细胞的增殖、侵袭和粘附能力的影响,并探讨在A375细胞中DKK1是否通过调节经典Wnt/β-catenin信号传导通路而发挥作用。 方法 (1)通过细胞计数、细胞平板克隆形成实验和MTT实验,观察差异表达DKK1后A375细胞的增殖能力的改变。 (2)运用Transwell小室侵袭实验和划痕实验,观察差异表达DKK1后A375细胞的侵袭能力的改变。 (3)运用肿瘤细胞与细胞外基质粘附实验,观察差异表达DKK1对A375细胞粘附能力的影响。 (4)通过PCR方法观察差异表达DKK1后A375细胞中β-catenin表达的变化。 结果 (1)高表达DKK1的A375组,细胞计数、克隆形成率及MTT吸光度值均小于对照组(P0.05),沉默DKK1的A375组细胞计数、克隆形成率及MTT吸光度值均大于对照组(P0.05)。 (2)高表达DKK1的A375细胞在Transwell小室侵袭实验中,穿膜细胞数为56±6个,比对照组明显减少(P0.05),在划痕实验中,36小时后划痕间隙最宽;沉默DKK1的A375细胞在Transwell小室侵袭实验中,穿膜细胞数为148±14个,比对照组明显增多(P0.05),在划痕实验中,36小时后划痕间隙最早消失。 (3)高表达DKK1的A375细胞与细胞外基质的粘附能力较对照组下降(P0.05),而沉默DKK1的A375细胞粘附能力较对照组增强(P0.05)。 (4)高表达DKK1的A375细胞中,β-catenin mRNA水平较对照组明显下降(P0.05),在沉默DKK1的A375细胞中,β-catenin mRNA水平较对照组明显增高(P0.05)。 结论 (1) DKK1能够抑制A375细胞增殖,而沉默DKK1可以促进A375细胞增殖。 (2) DKK1抑制A375细胞侵袭和迁移,而沉默DKK1能促进A375细胞侵袭和迁移。 (3) DKK1能抑制A375细胞粘附,而沉默DKK1能增强A375细胞粘附能力。 (4)在A375细胞中,DKK1通过抑制经典Wnt信号通路中的β-catenin的表达,从而发挥其抑制作用。 第四部分DKK1对人黑素瘤细胞裸鼠皮下种植瘤生长的影响 目的 研究差异表达A375细胞中DKK1后,对裸鼠皮下种植瘤生长的影响。 方法 将差异表达DKK1的A375细胞和对照组A375细胞分别接种到裸鼠背部皮下,定时测量肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。裸鼠处死后,完整剥离瘤体,称取瘤体重量,并将肿瘤固定于4%多聚甲醛,石蜡包埋,切片。切片用于免疫组织化学检测DKK1和β-catenin的表达水平。 结果 (1)高表达DKK1的A375组,肿瘤的体积、重量和生长速度明显低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。 (2)沉默DKK1的A375组,肿瘤的体积、重量和生长速度明显大于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。 (3)免疫组化显示,高表达DKK1的A375组,DKK1的表达明显高于对照组,沉默DKK1的A375组,DKK1的表达显著低于对照组。 (4)免疫组化显示,高表达DKK1的A375组,β-catenin蛋白的表达明显低于对照组,沉默DKK1的A375组,β-catenin蛋白的表达显著高于对照组。 结论 (1) DKK1能够抑制A375细胞裸鼠皮下种植瘤的生长。 (2)沉默DKK1的表达能促进A375细胞裸鼠皮下种植瘤的生长。 (3) DKK1通过调节Wnt信号通路下游β-catenin的表达,从而调节A375细胞裸鼠皮下种植瘤的生长。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.5

【引证文献】

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1 邢倩;高永良;陈瑾;;DKK1和β-catenin在寻常型银屑病中的表达[J];激光杂志;2012年02期

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本文编号：2264990