RasGRP1在湿疹发病中的作用及机制的研究

发布时间：2018-11-01 15:40

【摘要】：第一部分 RasGRP1在湿疹患者外周血单个核细胞及T细胞中的表达及意义目的研究RasGRP1在湿疹患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)1中的表达,纯化PBMC中的T细胞,进一步研究RasGRP1在湿疹患者外周血T细胞中的表达,并探讨其意义。方法使用Ficoll法提取湿疹患者及正常人外周血中的PBMC,采用免疫磁珠分选法从PBMC中分选T细胞,验证T细胞的分选纯度。使用RT-PCR及Western Blot方法检测湿疹患者及正常人外周血PBMC和T细胞中RasGRP1的表达。结果使用Ficoll法提取的外周血PBMC的纯度接近1000%,而使用免疫磁珠分选法分选T细胞,其纯度能达到98%以上。在PBMC中,湿疹患者RasGRP1的mRNA和蛋白质的表达水平明显高于正常人,在纯化后的T细胞中,湿疹患者RasGRP1的mRNA和蛋白质的表达水平也明显高于正常人。结论使用免疫磁珠分选外周血PBMC中的T细胞纯度较高。湿疹患者外周血PBMC及T细胞中RasGRP1的表达水平均增高,提示T细胞中RasGRP1的异常表达可能是湿疹发病过程中的一个重要因素。第二部分地塞米松对湿疹患者T细胞中RasGRP1表达的作用及意义目的研究地塞米松对湿疹患者外周血T细胞中RasGRP1的作用,筛选产生作用的最适浓度,并探讨地塞米松对T细胞的影响及意义。方法选取临床上使用地塞米松的重症湿疹患者,抽取其地塞米松治疗前及治疗后的外周血,并纯化T细胞。检测地塞米松治疗前后T细胞内RasGRP1的表达水平。在体外实验中,将地塞米松配成三种不同浓度1×10-5mol/L、1×10-6mol/L及1×10-7mol/L,与未用激素治疗的湿疹患者外周血T细胞共同培养,使用RT-PCR的方法检测T细胞内RasGRP1的mRNA水平。并得出最适合的作用浓度。将此浓度的地塞米松作用于T细胞,观察不同时间点(0h、6h、12h、18h、24h)地塞米松对T细胞内RasGRP1表达的影响。使用MTT的方法检测不同时间点、不同浓度的地塞米松作用于T细胞时,对细胞凋亡的影响。结果未使用地塞米松治疗时,湿疹患者T细胞内RasGRP1的表达高于正常人,使用地塞米松治疗1周后,T细胞内RasGRP1的表达明显下降,接近正常人的表达水平。地塞米松能抑制湿疹患者外周血T细胞RasGRP1的表达,在三种不同浓度的地塞米松中,1×10-Smol/L的浓度对RasGRP1表达的抑制作用最明显。使用浓度为1×104mo1/L的地塞米松对湿疹患者外周T细胞进行不同时间点的刺激,随着时间的延长,地塞米松的抑制作用加强。24h时地塞米松对T细胞内RasGRP1的抑制作用最强。而不同浓度的地塞米松均能促进T细胞的凋亡,这种作用呈时间依赖性。结论地塞米松能抑制湿疹患者外周血T细胞中RasGRP1的表达,并促进T细胞的凋亡。这种抑制作用随着地塞米松浓度的增加而增加,随着时间的延长而加强。湿疹患者在临床治疗时,使用地塞米松治疗1周后,外周血T细胞内RasGRP1的水平下降,接近正常人水平。这可能为激素的抗炎机制增加了新观点。第三部分构建含有H-RasGRP1-shRNA的慢病毒载体及其对T细胞的干扰效应目的以RasGRP1为靶点,构建含有目的基因H-RasGRP1-shRNA的慢病毒载体,转染T细胞对其进行RNA干扰,观察转染后T细胞表达RasGRP1的变化。研究基因沉默RasGRP1后对T细胞内Ras下游信号通路蛋白的影响,以及对细胞凋亡和细胞因子分泌的影响,并探讨其作用机制。方法构建含有目的基因H-RasGRP1-shRNA的慢病毒载体,并检测其生物学滴度。对T细胞进行转染,使用RT-PCR和Western Blot的方法检测转染后不同时间点(12h、24h、48h、72h)T细胞内RasGRP1的表达情况,并使用流式细胞仪检测T细胞的凋亡。使用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(Phorbol12-myristate13-acetate, PMA)及离子霉素刺激T细胞,观察T细胞内Ras蛋白下游信号通路蛋白p-Erk、Erk、Akt及p-Akt的表达。用ELISA的方法检测T细胞分泌细胞因子IL-2、IL-4及IL-17的情况。使用慢病毒载体转染PMA及离子霉素刺激后的T细胞,观察转染后T细胞内p-Erk、Erk、Akt及p-Akt蛋白表达的变化,以及T细胞分泌细胞因子的变化。结果成功构建H-RasGRP1-shRNA的慢病毒载体,其生物学滴度达到1.0×108TU/ml,符合转染要求。使用慢病毒载体转染T细胞后,T细胞内RasGRP1的mRNA及蛋白水平下降,随着时间的延长(12h、24h、48h、72h),RasGRP1的表达逐渐下降,72h时RasGRP1的表达几乎消失。同时转染后T细胞的凋亡加快。使用PMA及离子霉素对T细胞进行刺激,刺激前,湿疹患者和正常人T细胞内均有p-Erk、p-Akt、Erk及Akt的表达,且湿疹患者的表达高于正常人。使用PMA及离子霉素刺激后,p-Erk、p-Akt、 Erk及Akt的表达水平明显增高,以湿疹患者增加的更为明显。T细胞表达细胞因子IL-2、IL-4及IL-17的水平明显增加。用慢病毒颗粒基因转染PMA及离子霉素刺激后的T细胞,T细胞内p-Erk及p-Akt表达下降,而Erk及Akt的表达无明显变化。T细胞的培养上清液中分泌的细胞因子IL-2、IL-4及IL-17的表达水平下降。结论成功构建含目的基因H-RasGRP1-shRNA的慢病毒载体,其生物学滴度能满足转染要求。慢病毒载体能成功转染T细胞,抑制T细胞内RasGRP1的表达。RasGRP1基因沉默后,T细胞的凋亡增加。当湿疹发生时,T细胞受体活化后可能通过活化RasGRP1的表达,介导Ras蛋白的下游信号分子Erk及Akt的磷酸化,导致T细胞细胞因子释放增加。由此可见,RasGRP1可能成为湿疹治疗中的一个作用靶点,为基因治疗及免疫治疗提供新的思路。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R758.23

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