抑制STAT3磷酸化增强葫芦素B对B16F10黑素瘤细胞的细胞毒作用

发布时间：2018-11-12 15:22

【摘要】：目的： 葫芦素B（CuB）是从葫芦科植物中分离出的四环三萜类化合物，具有高度氧化性。近年研究发现，许多葫芦素与两面神激酶/信号转导子和转录激活子（Janus Kinase/signalTransducer and Activator of Transcription, JAK/STAT）通路有关，而STAT3信号通路与其关系最为密切。研究显示CuB能够通过抑制STAT3活化而发挥抗肿瘤效应。本研究的目的在于进一步探讨B16F10黑素瘤细胞中STAT3磷酸化与CuB抗肿瘤间的关系。 方法： 1.小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16F10细胞置于含体积分数为10%胎牛血清、质量浓度为100mg/L青霉素和链霉素的RPMI-1640培养液中，于37℃及体积分数为5%CO2的湿化培养箱中培养。 2. B16F10黑素瘤细胞在含有6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的AG490中培养24h、48h，应用MTS法观察AG490对细胞增殖活力的影响，计算细胞生长抑制率和IC50，并选择合适的AG490工作浓度。 3. CuB作用于B16F10黑素瘤细胞前，先用AG490预处理细胞2h。 B16F10黑色素瘤细胞分为对照组、AG490组、CuB组及AG490+CuB组，分别培养24h和48h后，利用MTS法进行细胞活性分析，全自动酶标仪测定490nm波长处A值，并计算药物对细胞存活率的影响。 4.碘化丙锭（PI）染色法检测20μM AG490对不同浓度CuB处理的B16F10黑素瘤细胞细胞凋亡和细胞周期的影响。 5.采用免疫印迹检测p-STAT3、STAT3以及MAPKs信号通路p-p38、p38、p-JNK、JNK蛋白的表达情况。 6.碘化丙锭（PI）染色法检测40μM SP600125对不同浓度CuB处理的B16F10黑素瘤细胞细胞凋亡和细胞周期的影响。 结果： 1. AG490预处理B16F10黑素瘤细胞2h后，再加入不同浓度的CuB作用24和48h，细胞增值率较单独CuB处理组有明显下降（P 0.05），提示AG490预处理可增强CuB对B16F10细胞的抑制作用。 2.细胞形态观察结果表明，AG490预处理对葫芦素B诱导的黑素瘤细胞形态变化影响不大，但相对于CuB单独作用组，AG490与CuB联合作用组凋亡细胞相对较多，且AG490与低浓度的葫芦素B作用还会引起细胞体积轻微变大。 3. CuB单独作用可明显影响B16F10黑素瘤细胞的周期分布。与对照组相比，CuB处理使G1期细胞显著减少，G2/M期细胞显著增加，形成四倍体细胞，并且低浓度药物诱导的四倍体细胞比率高于高浓度药物。AG490和CuB联合用药后，与CuB组细胞相比较，G1期细胞进一步减少，G2/M期阻滞更为明显，四倍体细胞的形成也明显减少。此外，AG490还可明显增加CuB诱导的凋亡峰比率（表2），两药联用表现协同作用。 4.免疫印迹显示，CuB作用4h后，p-STAT3蛋白表达有轻微升高，24h后，p-STAT3蛋白表达明显上调。单独AG490不改变p-STAT3水平，但可明显降低CuB引起的p-STAT3水平，使p-STAT3/STAT3的比值从CuB组的0.86降低为AG490+CuB组的0.55，提示AG490对CuB诱导的STAT3活化能够起到明显的抑制作用。此外，免疫印迹还显示CuB可以引起p38活化，而AG490预处理对葫芦素B引起的p38活化有一定的影响。 5.实验室先前的研究结果表明CuB也可引起JNK途径活化，，而JNK特异性抑制剂SP600125可以完全阻断这一途径，尽管SP600125对STAT3磷酸化没有作用，但是SP600125与CuB联合作用却能够完全抑制CuB引起的STAT3磷酸化。 6. CuB单独处理组的sub-G0/G1期细胞百分比为0.83±0.13%，而CuB与SP600125联合作用组的sub-G0/G1期细胞百分比与CuB单独处理组相比明显增多，分别为34.15±2.15%(1μM CuB和SP600125)、26.72±1.73%(10μM CuB和SP600125)。 结论： 1. CuB引起的STAT3磷酸化是一种代偿效应，其可以由JNK和Jak2途径共同介导。 2. CuB通过激活STAT3使B16F10细胞对其产生一定的抗性，抑制STAT3的活化在一定程度上能阻断肿瘤细胞对CuB的抗性，促进CuB的抗肿瘤效应。
[Abstract]:Purpose: cucurbitacin B (CuB) is a four-cyclic tri-polar compound separated from the plant of the cucurbitaceae, and has high oxygen content. In recent years, it has been found that many of the cucurbitacin are related to the two-sided kinase/ signal transduction and activator of transcription (JAK/ STAT) pathway, while the STAT3 signal pathway is the most important. The study shows that CuB can play an anti-tumor role by inhibiting the activation of STAT3. The purpose of this study was to further investigate the phosphorylation of STAT3 and the anti-tumor of CuB in B16F10 melanoma cells. The relationship. Methods: 1. The mouse melanoma highly metastatic cell line B16F10 was placed in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum with a mass concentration of 100 mg/ L of penicillin and streptomycin, and 5% CO2 at 37 鈩

本文编号：2327499