重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL的体外靶向生物学活性研究

发布时间：2018-12-05 16:02

【摘要】：背景皮肤T细胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma,CTCL)是一组异质性的T细胞来源的恶性肿瘤,以成熟CD4+的记忆性辅助T淋巴细胞在皮肤的恶性克隆性增生为特征,约占皮肤淋巴瘤的2/3以上。目前认为,CTCL在免疫学表型上属Th2或调节性T细胞(Treg),约50%~60%的CTCL表达IL-2R。早期CTCL治疗效果一般较好,但对中晚期CTCL目前尚无有效的治疗方法。随着对抗肿瘤免疫机制和CTCL生物学特性的深入研究,具有特异靶向杀伤肿瘤细胞的免疫毒素可作为其有效治疗方法的选择。免疫毒素是由毒素肽和靶向载体连接的具有靶向杀伤能力的融合蛋白,这种特异性靶向功能使之成为肿瘤靶向性治疗的一种新选择。利用基因工程技术进行克隆重组并在大肠杆菌中高效表达的融合蛋白具有稳定性好、组织渗透性高、免疫原性低、较强的肿瘤导向特异性和易于在细菌中大量制备等特点,使免疫毒素的实际应用成为可能。美国FDA已首次批准由IL-2和白喉毒素融合构建而成的免疫毒素药物DAB389IL-2(denileukin diftitox)用于治疗CD25+的复发性或顽固性CTCL,虽然临床取得一定疗效,但其对肝脏、心血管、造血系统等多系统损伤引起的严重副作用限制了它的广泛应用。分析其原因为:1、以全长IL-2作为靶向载体,特异性不够。IL-2R存在于许多细胞因子和正常细胞上(如静止T细胞、NK细胞等),且晚期CTCL患者皮损主要表达与IL-2低亲和力的IL-2Rα(CD25),因此不能高效引导毒素分子特异杀伤CTCL细胞。2、大多数人幼年曾接种白喉杆菌疫苗,或者接触过该病菌,因而体内携带白喉毒素的预存抗体,使该毒素疗效受到影响。因此针对特异性靶点、降低毒素的抗原性可以改进免疫毒素,提高其疗效。核糖体失活蛋白(RIPs)是一类植物来源的通过作用于真核细胞中核糖体和裸露原核的核糖体核糖核酸(rRNA),从而抑制蛋白质合成的细胞毒蛋白,按其结构不同可分为Ⅰ型和Ⅱ型,其中Ⅰ型RIP可直接用于制备免疫毒素。丝瓜素luffin a是最经典和研究最早的I型RIP,在丝瓜素家族成员中其毒性最强,九十年代初期已有将它与抗黑色素单克隆抗体化学偶联来靶向杀伤黑色素瘤细胞的报道。单链抗体(ScFv)是抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)通过一段连接肽(linker)连接而成的一种小分子抗体,具有分子质量小、穿透力强、半衰期短、免疫原性低、制备流程简单等优点,目前已广泛用于基因工程技术制备免疫毒素时靶向载体的选择。CD25单链抗体能特异性与表达CD25的肿瘤细胞结合,目前已有用CD25scFv作为靶向载体构建的重组免疫毒素用于治疗播散性霍杰金淋巴瘤的实验研究。基于以上理论基础,我们设想以丝瓜籽来源的I型核糖体失活蛋白α-luffin-KDEL作为毒素分子,CD25单链抗体(CD25scFv)作为靶向载体利用基因工程技术来构建表达一种新的重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL,探讨其体外靶向抗肿瘤活性,以期用于CD25+的皮肤T细胞淋巴瘤的实验研究。目的利用基因重组技术将从丝瓜籽来源的α-luffin-KDEL作为毒素分子,CD25scFv作为靶向载体构建、表达、纯化出重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL,以皮肤T细胞淋巴瘤来源的高表达CD25的Hut-78细胞作为主要测试对象,并以具有相似T细胞生物学行为但相对低表达CD25的Jurkat细胞和基本不表达CD25的B细胞来源的Burkitt淋巴瘤Raji细胞作为对照细胞,检测CD25scFv-α-luffin-KDEL对细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,探讨其体外靶向生物学活性。方法 1.依据成熟肽α-luffin的基因序列(GenBank NO:X62371.1)分别设计带有NcoI和XhoI酶切位点的引物,利用RT-PCR从未成熟丝瓜籽中克隆成熟肽α-luffin的cDNA和N端连接内质网滞留信号肽KDEL序列的α-luffin-KDEL基因,分别克隆至表达载体pET28a(+),经测序正确后,将之分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达、Ni~(2+)-NTA层析纯化,并用His抗体鉴定后,将获得纯化后的重组蛋白α-luffin和α-luffin-KDEL以不同浓度和不同时相点分别作用于JEG-3、HepG2和MCF-7肿瘤细胞,用CCK-8法检测两种重组蛋白分别对三种不同肿瘤细胞增殖的抑制作用,经SPSS 13.0软件对数据进行析因方差分析,比较重组蛋白α-luffin和α-luffin-KDEL的体外抗肿瘤活性。 2.以pET32a-anti-CD25-PE38KDELmutant质粒为模板扩增出带有BglII和NcoI酶切位点的CD25scFv片段,构建到表达载体pET32a(+),经测序正确后,将pET32a- CD25scFv与已构建好的pET28a-α-luffin-KDEL同时用NcoI和XhoI酶切后连接构建pET32a-CD25scFv-α-luffin-KDEL,经测序正确后,将之转化到大肠杆菌BL21DE3,诱导表达、Ni~(2+)-NTA层析纯化、透析复性,并His抗体鉴定重组蛋白;流式细胞仪检测Hut-78、Jurkat和Raji细胞表面CD25分子的表达情况;将所获得的重组融合蛋白CD25scFv-α-luffin-KDEL用CCK-8法检测其对Hut-78、Jurkat和Raji细胞增殖的影响,用Annexin V-FITC / PI双染法和PI法检测其对凋亡及细胞周期的影响。结果 1.(1)成功扩增出成熟肽α-luffin的cDNA,经查对,与GenBank上登录的编码成熟肽α-luffin的cDNA序列有一个碱基的突变,但不影响其编码的氨基酸序列。经比对,该成熟肽α-luffin与luffin a有96%的同源性。(2)成功构建了重组原核表达质粒pET28a-α-luffin及pET28a-α-luffin-KDEL,并在大肠杆菌BL21DE3plysS中获得部分可溶性表达,分子量28kDa左右,经Ni~(2+)-NTA层析纯化,western blot鉴定为所需目的蛋白α-luffin和α-luffin-KDEL。(3)CCK-8法检测结果显示:两种蛋白对三种肿瘤细胞增殖的抑制作用均存在明显的时间及剂量依赖性关系,且对三种肿瘤细胞的抑制作用存在明显差异,即对JEG-3细胞增殖的抑制作用较强,对MCF-7细胞的作用较弱;在不同浓度和不同时相点比较两个蛋白对细胞增殖的抑制作用,结果显示α-luffin-KDEL对三种肿瘤细胞的抑制作用均显著强于α-luffin。 2.(1)成功构建重组质粒pET32a-CD25scFv-α-luffin-KDEL,经大肠杆菌BL21DE3诱导表达出包涵体形式的融合蛋白,分子量约80kDa左右,经纯化、复性、western blot鉴定,获得所需目的蛋白CD25scFv-α-luffin-KDEL。(2)流式细胞仪检测Hut-78、Jurkat和Raji细胞表面CD25分子的表达分别为87.5%、26.9%和0.2%。(3)免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL对Hut-78、Jurkat和Raji细胞增殖影响的结果显示:CD25scFv-α-luffin-KDEL对三种细胞增殖的抑制作用具有浓度和时间依赖性;且对Hut-78细胞增殖的抑制作用明显强于对Jurkat和Raji细胞,对Jurkat和Raji细胞的抑制作用未表现出明显差异;CD25scFv-α-luffin-KDEL对Hut-78和Jurkat细胞的抑制作用明显强于α-luffin-KDEL;作为对照的α-luffin-KDEL对三种细胞增殖的抑制作用未表现出明显差异。凋亡和细胞周期检测结果显示:CD25scFv-α-luffin-KDEL对Hut-78和Jurkat细胞表现出明显的促凋亡作用;且明显减少Hut-78及Jurkat细胞的S期细胞数目,使细胞生长阻滞于G0/G1期和G2/M。结论本研究主要结论:1、从丝瓜籽中克隆表达的重组成熟肽α-luffin和在N端添加内质网滞留信号肽的α-luffin-KDEL均具有体外杀伤肿瘤细胞的作用,且α-luffin-KDEL的作用更强。2、利用基因工程技术以α-luffin-KDEL作为毒素分子,CD25scFv作为靶向载体构建表达的重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL在体外实验中表现出很好的靶向杀伤表达CD25肿瘤细胞的作用,其机制可能系通过靶向促凋亡作用和作用于间期中DNA的合成,从而抑制了靶向细胞的增殖。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R739.5

【参考文献】