Id1在血管瘤发病中的作用及其机制探讨

发布时间：2019-09-12 02:52

【摘要】：血管瘤是发生于婴幼儿的最常见的良性肿瘤之一,主要由紊乱的血管和大量不成熟的内皮细胞组成。发病率高达10～12%,严重影响患儿容貌、受累器官的功能、心理健康等,现代医学主张以积极的态度对该病进行早期治疗。但由于对其发病机制缺乏足够的认识,致使治疗效果整体上差强人意。 Id(DNA结合抑制因子/分化抑制因子)属于转录调节因子家族,它通过作用于多种信号传导而抑制细胞分化,促进增生和转移,在细胞恶变和转移过程中发挥了关键作用.哺乳动物细胞含4种Id因子(Id1、Id2、Id3、Id4),这些因子参与细胞周期调节过程,包括细胞发育、成熟、生长、分化和凋亡等,其中Id1与肿瘤发生的关系最为密切。Id1通过抑制细胞分化,推进细胞周期进程、诱导细胞增殖、抑制衰老、诱导侵袭、参与肿瘤性血管新生而介导肿瘤的发生和发展。 鉴于Id1对于肿瘤中血管新生方面的突出作用,笔者将目光锁定在以大量紊乱的血管及不成熟内皮细胞为主要标志的的血管瘤上面。通过临床标本上检测Id1在血管瘤中的表达情况,并对体外培养的血管瘤细胞进行RNA干扰,以研究Id1在血管瘤发病中的作用并对其机制进行探讨。 材料与方法： 第一部分：用免疫组化分别检测12例增生期血管瘤、10例消退期血管瘤、9例血管畸形、7例淋巴管畸形组织及4例动静脉畸形中的Id1的表达。将增生期血管瘤组织及瘤周正常皮肤组织分别用Trizol裂解液提取总RNA,将总RNA逆转录为cDNA,然后用Id1引物进行(Real-timefluorescence quantitative PCR, RFQ-PCR)实验,检测两种组织中Id1基因的mRNA表达情况,再取增生期血管瘤组织及瘤周正常皮肤组织,常规提取总蛋白,一抗二抗孵育,进行Western blot实验,检测两种组织中的蛋白表达情况。 第二部分：用组织块培养的方法培养增殖期血管瘤内皮细胞,在细胞生长的对数期,用设计好的Id1干扰慢病毒(Id1-RNAi-lentivirus)及空载体慢病毒(Id1-NC-lentivirus)分别进行转染,用荧光观测、RFQ-PCR、 Western blot确认干扰成功,用MTT比色法描记干扰前后细胞生长曲线的变化、用TUNEL检测干扰前后细胞凋亡的改变,用WESTERN blot及PCR检测干扰前后HIF-1α水平的改变,用免疫组化的方法定性检测干扰前后iNOS表达的改变；用ELISA检测干扰前后VEGF的改变。用Tube formation观测干扰前后血管瘤内皮细胞成管能力的改变。 结果： 第一部分：免疫组化结果显示增生期血管瘤组织中Id1表达整体呈强阳性,阳性率高达90.3%.消退期血管瘤Id1表达整体呈弱阳性趋势,阳性率53%；血管畸形、淋巴管畸形及动静脉畸形整体阳性率较弱,依次为52%、57%、53.7%。RFQ-PCR显示增生期血管瘤组织中Id1的(?)nRNA水平明显高于瘤周正常皮肤组织。Western blot显示增生期血管瘤组织中Idl的蛋白表达水平明显高于瘤周正常皮肤组织。 第二部分：实验结果显示荧光观测、RFQ-PCR、Western blot确认干扰成功。MTT比色法描记的干扰前后细胞生长曲线结果显示：干扰后hemECs增殖能力下降,与未干扰组有显著差异。TUNEL检测干扰前后细胞凋亡结果显示：干扰后hemEC凋亡明显增多,与未干扰组有显著差异。RFQ-PCR及WESTERN blot检测干扰前后HIF-1α含量变化显示：干扰后HIF-1α RNA水平并无明显降低,但蛋白含量减少,与未干扰组有明显差异。免疫组化的方法定性检测干扰前后iNOS表达的改变,发现干扰后iNOS整体阳性率下降,阳性强度变弱。ELISA检测干扰前后VEGF的改变,结果显示,干扰后VEGF的含量减少,与对照组有明显差异。Tube formation观测干扰前后血管瘤内皮细胞成管能力的改变,结果显示干扰后成管能力下降,且成管持续时间减少,管壁消退快,与对照组相比有明显差异。 结论： 第一部分：实验结果提示,Idl在淋巴管畸形、静脉畸形、动静脉畸形仅在有管腔结构的部位表达,其余部分不表达或低表达,Id1在增生期血管瘤组织中呈现高表达,在消退期血管瘤中低表达,且表达强度随消退成分的多少而改变。增生期血管瘤中Id1的表达在RNA水平及蛋白水平均高于瘤周正常皮肤组织,提示Id1在血管瘤发病中或起重要的作用。 第二部分：结果显示沉默Id1后,血管瘤内皮细胞的增殖及成血管能力降低,但凋亡增多。而其下游分子HIF-1α、VEGF、iNOS的含量降低,提示干扰Id1之后,导致通路上的因子含量发生改变,从而导致血管瘤内皮细胞增殖、凋亡、成血管能力的改变,诱发血管瘤的消退。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.5

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