DLL1基因在小鼠B16黑色素瘤形成中的作用研究

发布时间：2019-11-02 23:20

【摘要】：Notch信号通路是进化上高度保守的细胞与细胞间的信号传导系统,通过调控细胞的分化、增殖、凋亡的命运选择,在胚胎正常发育、机体稳态调控以及成体干细胞的维持中发挥重要作用。在胚胎血管发育过程中,Notch信号通路调控着动静脉血管的分化和血管内皮Tip细胞和Stalk细胞的命运选择,对胚胎血管网络正常结构和功能的维持起到了关键作用。Notch信号通路调控的异常往往由于血管网络发育的缺陷而导致胚胎死亡。在成体生理性新生血管形成中,Notch信号通路的激活限制了血管的过度生成,维持了机体的稳定。在肿瘤血管中,DLL4的表达显著增高,阻断DLL4激活的Notch信号通路引起了肿瘤血管的无功能性过度生成,使肿瘤的血流灌注减少而抑制了肿瘤的生长;而过表达DLL4虽然肿瘤血管的生成,但却改善了肿瘤血管的结构和灌流功能,促进了肿瘤的生长。但与此同时,也有研究证实Notch的另一配体Jagged1能通过促进肿瘤的功能血管的形成而促进肿瘤的生长。鉴于Notch信号通路的调控作用环境依赖性(Context-dependent)和Notch分子间的功能特异性,我们检测了另外一个Notch配体DLL1在肿瘤血管中的作用。DLL1调控胚胎期动静脉血管的分化和成体损伤后血管的形成。但其在肿瘤血管中的作用还没有详细的研究报道。我们在DLL1与肿瘤血管的研究中主要做了以下工作: 1、构建共表达DLL1蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达质粒。通过设计特异引物,利用PCR方法扩增出DLL1基因片段,测序正确后连接通过到pIRES2-EGFP质粒中;然后对新构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒进行了酶切鉴定和测序。 2、在体外实验中发现DLL1的表达促进肿瘤细胞的体外增殖。通过分别转染pIRES2-EGFP-DLL1质粒和pIRES2-EGFP质粒,药物筛选建立了稳定表达DLL1基因和GFP基因的B16黑色素瘤细胞系;检测发现DLL1激活了肿瘤细胞Notch信号通路;MTT和软琼脂克隆形成实验表明DLL1的表达促进了肿瘤细胞的增殖和克隆的形成。 3、观查到DLL1通过减少肿瘤血管的生成抑制了肿瘤在小鼠体内的生长。小鼠皮下荷瘤实验发现实验组肿瘤在小鼠体内的生长长受到抑制,基因检测发现Notch通路在肿瘤中激活,免疫荧光和免疫组化实验证实血管肿瘤中血管形成减少,肿瘤组织血供障碍,缺氧程度加重,坏死增加。结论:综上所述,我们的研究认为DLL1在肿瘤细胞中的表达能通过肿瘤细胞间的相互作用激活HES1、HEY1等Notch下游基因,促进肿瘤细胞的增殖和克隆的形成。但在B16-DLL1肿瘤在小鼠体内的生长并没有相应的加速,反而受到了抑制。可能原因是肿瘤的快速增殖需要与营养的供应相适应,而DLL1的表达一方面促进了肿瘤细胞的增殖,另一方面却使肿瘤血管的生成减少,结构紊乱,扰乱了肿瘤的血液供应,加重了肿瘤内部缺血缺氧情况,使肿瘤组织坏死增加,从而抑制了肿瘤的生长。
【图文】：

受体,配体

第四军医大学硕士学位论文图1 、Notch受体和配体的结构（引自DumortierA. etal.IntJHematol.2005）1.3 Notch 信号的激活过程（图 2）Notch信号激活需要三个重要的步骤：①Notch受体和配体的识别与结合。配体的DSL基序与受体的第11、12位EGF序列相互作用，激活相关的蛋白水解酶。②Notch胞内段（NICD）从细胞膜上酶切释放。Notch受体需要经过两次酶切才能释放具有活性的NICD进入细胞核。第一次由肿瘤坏死因子-α-转化酶(TNF-α-converting enzyme，TACE)在S2位点酶切，释放胞外区[9]；第二次由早老蛋白（Presenilin）依赖的γ-secretase复合物在S3位点酶切，释放NICD[10-11]。③ NICD核内转录复合物的形成。NICD在细胞核内不能直接与DNA结合，首先需要通过RAM结构域和ANK结构域与转录因子CSL(CBF1/RBP-J，Su[H]，Lag1)相作用

信号通路

图2 Notch信号通路的激活（引自John Panelos et al Cancer Biology &Therapy 2008）二、Notch 信号通路对血管形成的作用1 Notch 分子在血管上的表达⑴Notch受体在血管内皮细胞和血管平滑肌中都有表达：Notch1 广泛表达在心脏和血管内皮细胞上，，而Notch4 特异表达在血管内皮细胞上表达[14-15]；Notch3 则主要表达在血管平滑肌细胞上[16-17]。一般认为Notch受体和配体主要表达在较大动脉血管内皮细胞中，但在毛细血管和静脉中也检测到了Notch分子的表达[15-18]。 ⑵Notch配体中除了Dll3，其他配体 (DLL1，DLL4， Jagged1 和Jagged2)都能在血管内皮细胞上检测到[18]。其中DLL4 是被认为是血管中最重要的Notch配体，在胚胎期主要表达在小血管和毛细血管中，成体后表达下降，但在机体新生血管和肿瘤血管表达又会升高[19-20]。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.5

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