miR-423-5p调控过氧化氢诱导下人黑素细胞氧化损伤的机制研究

发布时间：2019-11-21 12:14

【摘要】：白癜风是一种临床常见的慢性色素障碍性皮肤病,主要由病变部位黑素细胞的缺失或功能丧失引起。有关白癜风发病机制尚未完全阐明。近年来大量研究显示氧化应激在白癜风黑素细胞损毁中扮演了重要角色。 正常机体处于氧化-抗氧化系统的动态平衡之下,打破这种平衡会导致机体发生氧化应激损伤。大量证据表明白癜风患者存在氧化-抗氧化水平失衡。白癜风中患者表皮内过量H_2O_2蓄积,外周血红细胞SOD活性及脂质过氧化水平显著升高,血浆MDA浓度增高,外周单个核细胞中DNA链断裂及DNA碱基被氧化的水平升高,皮损处MSR表达水平及活性明显下降,Nrf2浆核分布比例失调,以及氧化应激相关基因多态性与白癜风遗传易感性相关的大量研究,直接或间接的证实氧化应激在白癜风发病中的重要作用。 microRNA(miRNA)是一类非编码单链小RNA分子,长约21-22个nt,主要与其靶基因mRNA通过特异性的碱基互补配对,在转录后对基因进行负表达调控。既往研究显示miRNA分子参与细胞氧化应激反应。在H_2O_2、电离辐射或依托泊甙等不同条件诱导的氧化应激情况下,存在多种miRNA分子表达异常改变。而在多种发病与氧化应激相关的疾病中,如心力衰竭、心肌病、神经退行性疾病等,表达异常改变的miRNA分子发挥着促氧化反应和抗氧化应激的双向调节功能,提示miRNA分子参与机体抵御应激反应或导致机体氧化应激损伤。因此,寻找与人黑素细胞氧化应激相关的miRNA分子,研究氧化应激条件下miRNA对黑素细胞的功能影响,探讨miRNA参与黑素细胞氧化应激的分子机制,为白癜风机理研究和临床治疗药物开发提供新的思路和理论依据。 方法 使用适当浓度的H_2O_2对永生化的人表皮黑素细胞PIG1及永生化的白癜风患者正常黑素细胞PIG3V进行处理,与处理前的PIG1及PIG3V黑素细胞进行microRNA芯片表达谱差异分析,继而通过实时荧光定量RT-PCR进行差异表达验证,初步筛选出相关miRNA进行功能学研究。使用筛选出的miRNA分子特异性前体及抑制物瞬时转染PIG1及PIG3V黑素细胞,设置转染后H_2O_2处理组,通过检测细胞活力和凋亡,以及细胞内ROS、MDA、SOD、GSTs的表达水平,观察miRNA对H_2O_2处理黑素细胞氧化应激状态及细胞活性的影响。生物学预测软件预测miRNA可能调控靶基因,通过报告基因试验验证miRNA与预测靶基因之间的关系。RT-PCR及Western Blot试验进一步验证miRNA对靶基因调控作用;基因转染、Western Blot试验和细胞活力检测明确miR-423-5p/GSTM1信号通路在H_2O_2诱导下人黑素细胞氧化损伤中的作用。 结果 1.通过对miRNA芯片表达谱进行差异分析,我们发现在使用H_2O_2处理后,PIG1黑素细胞中有10个miRNA分子表达水平发生改变,其中7个miRNA分子表达上调,3个miRNA分子表达下调;而在PIG3V黑素细胞中,则有3个miRNA分子表达上调,5个表达下调。有3个miRNA分子(miR-93、miR320b和miR-423-5p)在两种黑素细胞中表达均发生改变。进一步通过实时荧光定量RT-PCR对这3个miRNA分子进行验证,结果显示,H_2O_2处理后miR-93和miR-320b在PIG1黑素细胞中表达较处理前下降(p0.05),在PIG3V黑素细胞中表达上调(p0.05),与芯片方向不完全相符;miR-423-5p在H_2O_2处理后的两种黑素细胞中表达较处理前均上调(p0.05),且在PIG3V细胞处理前后表达水平具有显著差异(p0.01),结果与芯片方向一致。 2.使用特异性miR-423-5p前体及抑制物转染PIG1和PIG3V黑素细胞,能够成功使黑素细胞中miR-423-5p的表达上调和下调。与未转染组及转染对照组相比,在H_2O_2处理后上调miR-423-5p表达的黑素细胞,细胞活力降低,凋亡比例增大,细胞内ROS水平及MDA水平升高,而SOD、GSTs活性下降。下调miR-423-5p表达的黑素细胞活力增加,凋亡细胞减少,ROS、MDA水平降低,而SOD、GSTs活性增加。 3.通过生物学软件我们初步预测GSTM1是miR-423-5p的靶基因。报告基因试验结果证实,GSTM1通过3’UTR位点与miR-423-5p结合,从而受miR-423-5p的抑制。RT-PCR及Western Blot结果显示,在H_2O_2处理后,与转染对照组相比,特异性上调/下调miR-423-5p的表达后,GSTM1的mRNA表达无明显变化,而蛋白水平则发生了明显改变。进而我们通过基因转染、Western Blot试验和细胞活力检测发现,miR-423-5p不仅仅可负性调控GSTM1在H_2O_2诱导下人黑素细胞中的表达,并确实通过下调GSTM1蛋白表达介导了H_2O_2诱导下人黑素细胞的氧化损伤。 结论 1. miR-423-5p在H_2O_2处理前后的人黑素细胞具有表达差异,可能参与黑素细胞氧化应激反应。 2. miR-423-5p能够降低H_2O_2诱导的氧化应激条件下人黑素细胞活力,促进黑素细胞凋亡,增加黑素细胞氧化应激水平,降低细胞抗氧化能力。miR-423-5p是调控人黑素细胞氧化应激损伤的危险性因素。 3. miR-423-5p通过GSTM1介导人黑素细胞氧化应激损伤。GSTM1具有抗氧化能力,miR-423-5p影响人黑素细胞的抗氧化能力,导致人黑素细胞的氧化应激损伤,部分是通过对GSTM1表达的负性调控来实现的。
【图文】：

第四军医大学博士学位论文成熟加工。在细胞浆中，，pre-miRNA在Dicer酶（另一种RNase Ⅲ酶）及其辅助因子P的作用下，被剪切成具有5′端磷酸基和3′端2nt突出21-25nt长度的NA:miRNA*成熟双链。在TRBP募集作用下，TRBP、Argonaute蛋白与r酶三者共同形成三聚复合物，启动RNA诱导的沉默复合体（RISC）的。双链miRNA在解旋酶的作用下被解旋，其中5′端相对不稳定的一条NA链整合进RISC，结合到与其互补的mRNA 的位点，通过碱基配对识基因发挥调控作用，另一条链则被特异性降解。

理浓度的增加而显著下降。以未使用 H2O2处理的 PIG1 黑素细胞组的 OD 检测值为 100%，当 H2O2浓度为 0.5mM 时，PIG1 黑素细胞活力开始下降(78.93±6.85)%（p<0.05）；当 H2O2浓度为 0.75mM 时，PIG1 黑素细胞活力出现显著下降(56.77±8.37)%（p<0.01）（图 1 左）。因此，我们首先将 H2O2处理浓度固定为 0.75mM。当 H2O2处理浓度固定为 0.75mM，我们分别选取H2O2处理的不同时间点检测 PIG1 黑素细胞的活力。结果显示：PIG1 黑素细胞活力随 H2O2处理时间的延长而显著下降。以未使用 H2O2处理的 PIG1 黑素细胞组的 OD 检测值为 100%，当 H2O2处理 3h 时，PIG1 黑素细胞活力即开始下降(83.53±6.29)%（p<0.05）；当 H2O2处理 24h 时，PIG1 黑素细胞活力出现显著下降(58.87±5.90)%（p<0.01）（图 1 右）。根据上述实验结果，我们选择 0.75mM H2O2处理 24h 作为实验条件进行下一步实验，这主要是因为该浓度和时间点下 H2O2既能诱导 PIG1 黑素细胞产生氧化应激损伤，又不会导致 PIG1 黑素细胞死亡过多而影响实验结果的分析。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R758.41

【共引文献】

相关期刊论文 前10条

1 王小兰;刘顺枝;姚焱;何光存;;水稻WNK mRNA在水稻根中的表达[J];安徽农业科学;2009年14期

2 余华顺,张林生;小麦种子萌发过程中类PvLEA-18的表达[J];西北植物学报;2002年01期

3 杜志方,刘芳;新生儿窒息复苏的新观点——空气复苏[J];国外医学(儿科学分册);2004年04期

4 孔元蓉;王自能;;纯氧复苏对窒息新生儿心肌的影响[J];海南医学;2007年02期

5 孙丽娜;彭艳艳;金露;宋菁;王小同;;缺氧对小鼠离体脑线粒体氧化应激的影响[J];中国临床神经科学;2012年01期

6 刘静;田利民;;氧化应激与胰岛β细胞伤害及其对策[J];实用糖尿病杂志;2007年03期

7 汤玲珍;坚哲;刘邦民;李凯;李强;李春英;高天文;;阿司匹林对正常人表皮黑素细胞系PIG1细胞黑素生成的影响[J];中国美容医学;2012年04期

8 唐愿映;姬爱冬;邹缄;刘沸珍;;内膜复原汤对受损子宫内膜线粒体功能调控机制的临床研究[J];中国民族民间医药;2010年21期

9 刘树森;;线粒体呼吸链与活性氧[J];生命科学;2008年04期

10 贾彩凤,李悦,瞿超;木本植物体细胞胚胎发生技术[J];中国生物工程杂志;2004年03期

相关会议论文 前1条

1 刘超;张允岭;陶冶;张锦;郑宏;王新祥;刘雪梅;闫妍;;从缺血再灌大鼠皮层线粒体能量代谢异常探讨急性脑梗死络损机制[A];中华中医药学会脑病分会成立大会暨2008年全国中医脑病学术研讨会论文汇编[C];2008年

相关博士学位论文 前10条

1 陈少瑜;丽江云杉体胚发生体系优化及体胚发育过程蛋白质组分析[D];云南大学;2010年

2 张海宁;血管性认知障碍大鼠脑突触小体的差异蛋白质组学研究[D];吉林大学;2011年

3 杨广珍;肝癌癌蛋白p28~（GANK）增强细胞氧化应激耐受的作用与机制研究[D];第二军医大学;2011年

4 安毛毛;Allicin协同两性霉素B抗白念珠菌机制研究[D];第二军医大学;2011年

5 张昱;PJ-34对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其抗氧化应激损伤的机制研究[D];浙江大学;2011年

6 王昊宇;C_(60)衍生物的超分子组装及其生物活性的研究[D];吉林大学;2011年

7 刘国宝;二种大豆LEA4蛋白的金属离子结合特性及对生物大分子的保护作用[D];东北师范大学;2011年

8 Samar Abd Elaziz Omar;[D];中国科学院研究生院（西双版纳热带植物园）;2009年

9 李煜;大熊猫成纤维细胞体外培养与异质克隆胚构建[D];西北农林科技大学;2001年

10 白晓春;氧化应激中磷脂酶C-γ1信号通路促进细胞存活及其分子机制[D];第一军医大学;2002年

相关硕士学位论文 前10条

1 林福全;InnVit基因对黑素细胞生物学功能的影响及其分子机制[D];浙江理工大学;2010年

2 傅佳;海参虫草复剂降血糖作用及其机制的研究[D];中国海洋大学;2010年

3 赵丽;原花青素对STZ损伤INS-1细胞的保护和修复作用[D];兰州大学;2011年

4 尹小妹;吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对2型糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的影响[D];河北医科大学;2011年

5 田茜;人工老化对大豆种子线粒体结构功能和抗氧化系统的影响[D];中国农业科学院;2011年

6 王晶晶;不同时期2型糖尿病患者短期胰岛素强化治疗疗效观察[D];郑州大学;2011年

7 孙霞;PCF经ROS/UCP2/cytoC信号通路对UVA诱导的HaCaT细胞凋亡的调控[D];中国海洋大学;2011年

8 张全江;褪黑激素及耐力训练对小鼠部分生化指标与肝细胞超微结构的影响[D];陕西师范大学;2001年

9 战旗;谷氨酰胺和耐力训练对大鼠抗氧化水平及免疫功能影响的实验研究[D];陕西师范大学;2002年

10 山红艳;番茄组织培养体系的建立及特异蛋白表达差异的研究[D];东北师范大学;2002年

本文编号：2564004