山东省家兔皮肤真菌病病原ITS序列测定及遗传变异分析

发布时间：2019-11-30 13:22

【摘要】：皮肤真菌病是人畜共患接触性皮肤传染病,又称脱毛癣,对人和动物健康形成极大的威胁。皮肤真菌包括三个属,即毛癣菌属(Trichophytonsp)、小孢子菌属(Microsporumsp)和表皮癣菌属(Epidermophytonsp),它们可以侵犯皮肤、毛发和指(趾)甲,寄生或腐生于表皮角质、毛发和甲板的角蛋白组织中,引起浅部真菌病。引起家兔皮肤真菌病的病原菌主要是须毛癣菌(Trichonphyton mentagrophyton),石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum),犬小孢子菌(Microsporum canis)。不论是从家兔皮肤病灶处或从非病灶处分离到这三种菌均视为异常,因为非病灶处的真菌很可能随后引起皮肤病,同时造成饲养和实验人员的感染。山东为养兔大省,家兔皮肤真菌病已对养兔业造成很大损失。目前对皮肤病原真菌检测主要是依靠真菌培养物的菌落形态及真菌菌丝的显微镜观察。镜检虽然快速,但需要有多年的实践经验,并很难鉴别到种。实际上,真菌的表型特征很容易受到外界因素的影响,例如温度变化,培养基成份和化学治疗,这些都影响真菌代谢过程,从而影响结果的观察。而且要想得到典型的真菌菌落形态和镜下特征一般需要2~3周的培养时间,对一些缺少特异的形态及镜下特征的菌种还需要进行特殊培养基的第二次培养。因而,建立皮肤真菌病的快速诊断方法、分离获得山东省兔场皮肤真菌致病菌株、探明其变异现状及耐药性,对有的放矢防治该病具有重要意义。本试验在比较了分子生物学方法和常规实验室检测方法分离鉴定皮肤真菌病原优劣的基础上,分离获得了山东流行菌株,并通过对皮肤真菌的ITS区基因进行克隆、测序,探讨了分离株的变异及遗传进化关系,然后对分离株进行了耐药性检测,获得了令人满意的结果。本研究分以下三部分内容: 首先,根据皮肤真菌特异性rDNA序列设计通用引物,对已知菌株及其他微生物进行PCR检测并克隆测序,验证PCR方法对鉴定皮肤真菌病原的特异性、灵敏度等优点,结果显示,检测的已知菌株可在650bp-770bp之间扩增出特异片段,但其它微生物、兔体细胞和健康种兔样品均未扩增出类似片段。另外,将PCR方法与常规分离培养鉴定方法比较,结果发现,检出率前者高于后者(分别为82.8%和60.55%)。然后采用以上两种方法从山东省主要兔场分离鉴定出9株兔源性皮肤真菌,其中须癣毛癣菌6株,石膏样小孢子菌2株,犬小孢子菌1株。其次,利用皮肤真菌内转录间隔区保守序列设计通用引物,对采自山东地区主要兔场的16株皮肤真菌分离菌进行了ITS区的克隆、测序,探讨了序列变异及遗传进化关系。结果显示,不同病原菌的5.8 SrDNA序列高度保守,而ITS区的变异性较高;对该区序列的聚类分析表明,不同种菌株ITS1比ITS2在碱基构成上和序列长度有更大变异;而种内各菌株的ITS1和ITS2在长度上均没有变异,碱基构成上存在微小的变异,可基于该区进行兔皮肤真菌的分类鉴定。该研究确定了兔皮肤病原PCR检测特异引物的靶序列,为兔皮肤真菌病病原的特异性分子鉴定提供了可靠的靶标,也为兔皮肤真菌的科学分类提供了分子依据。同时,通过对分离株ITS区的克隆、测序及分析,得出与传统的形态学分类不一致的结果。传统的形态学分类认为:石膏样小孢子菌和犬小孢子菌同属小孢菌属,须癣毛癣菌和红色毛癣菌等均属于毛癣菌属;但本实验的序列分析结果显示:石膏样小孢子菌与须癣毛癣菌的同源性较犬小孢子菌高。最后,采用ATB FUNGUS 3进行药敏试验,分析引起山东省家兔皮肤真菌病病原的耐药性,结果显示,分离的皮肤真菌病原菌均对两性霉素B、5-氟胞嘧啶、伏立康唑和伊曲康唑敏感,分别为83.33%、68.75%、75%和64.41%,而对氟康唑具有耐药性,仅20.83%敏感。其中犬小孢子菌对两性霉素B最为敏感(87.5%),须癣毛癣菌和石膏样小孢子菌次之(81.25%)。该试验结果为家兔皮肤真菌病的科学防治提供了科学依据。
【图文】：

通用引物,PCR检测,特异性,皮肤真菌

）上游：5’AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG 3’下游：5’CTCTTGCCGCTTCACTCG 3’；）上游：5’GTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCG 3’下游：5’GGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTG 3’；通过对以上引物特异性、扩增片段大小等比较，筛选出最佳引物（11）命引物 rDNA1 / rDNA2。通用引物 rDNA1 / rDNA2 特异性检测采用皮肤真菌通用引物 rDNA1 / rDNA2 对 4 株阳性菌和 5 种其他微生物性检测，结果见图 1。

通用引物PCR,直接镜检,病料,通用引物

图 2 通用引物 PCR 扩增 rDNA-ITS 区Fig. 2 Universal primer PCR amplification of rDNA-ITS注：M：Marker； 1-3：石膏样小孢子菌；4-6：毛癣菌；7-9：犬小孢子菌；10：对照ote: M：Marker ; 1-3: Trichonphyton mentagrophyton; 4-6: Trichophyton ; 7-9: Microsporum canis; 10: Compar4 病料直接镜检病料直接镜检的阳性率为 67.18%（172/256），，低于通用引物 PCR的诊断结果
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R756

【参考文献】