豚鼠骨髓间充质干细胞对皮肤光老化治疗作用的实验研究

发布时间：2020-03-21 02:19

【摘要】： 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cellls,BMSCs)移植在修复慢性损伤以及损伤组织的重建中均起着重要作用。大量研究结果表明,将分离纯化的BMSCs接种于表皮细胞诱导体系中,诱导的细胞大部分转化为表皮干细胞;同时也观察到BMSCs在体内外实验中均可参与真皮组织的重建。目前,关于BBMSCs、皮肤光老化及其发生机制的相关研究较多,但BBMSCs在皮肤光老化治疗中的应用国内外尚未见报道。 本文采用贴壁法体外分离、纯化及扩增BMSCs,通过MTT法检测豚鼠BBMSCs的生长特征,流式细胞术分析BMSCs细胞周期及细胞表面CD34表达情况,综合鉴定所分离纯化的BMSCs;通过建立豚鼠皮肤光老化动物模型,经肉眼观察、HE染色、Masson特染及天狼星红染色研究BMSCs对豚鼠皮肤光老化的预防及治疗作用;应用免疫组织化学、天狼星红染色、ELISA检测及PCR鉴定供体雄性豚鼠Y染色体性别决定区SRY序列研究BMSCs对皮肤光老化预防及治疗作用的机制。 1. BMSCs分离、纯化及其体外培养的形态学特征 接种到培养瓶的骨髓细胞,传代培养2～3代后,细胞形态变得较为一致,似成纤维样细胞;MTT法绘制生长曲线证实骨髓基质细胞系体外培养具有非常旺盛的增殖活性;流式细胞仪检测出85.87%的细胞处于G0-G1期,且基本不表达CD34。 2.豚鼠皮肤光老化动物模型的制备及鉴定 UVA、UVB两个波长的紫外光同时照射60天后,豚鼠照射区域皮肤表现弹性丧失,出现皱纹及皮革样外观,并伴有皮屑、色素沉着等改变。镜下观察可见:表皮增厚,真皮乳头数减少,表皮与真皮交界平坦;真皮厚度变薄,密度降低,炎症细胞与肥大细胞数量增加;皮肤表皮厚度显著增加;真皮层弹性纤维明显增多,变粗;胶原纤维明显减少。 3. BMSCs对皮肤光老化的预防治疗作用UVA、UVB紫外线同时照射2周后,在豚鼠皮肤照射区局部多点皮内注射BMSCs,照射60天结束时观察,模型组与正常对照组相比,表皮明显增厚,且有色素沉着,BMSCs预防治疗组与模型组相比,表皮明显变薄,真皮乳头数增多,炎症细胞与肥大细胞数量减少,真皮层弹性纤维明显减少,胶原纤维明显增多,接近正常皮肤结构。 4. BMSCs对皮肤光老化的治疗作用 紫外线照射60天后,在豚鼠皮肤照射区局部多点皮内注射BMSCs,治疗30天。结果发现,BMSCs预防治疗组与模型组、自然恢复组相比,表皮变薄,真皮乳头数增多,弹性纤维减少,胶原纤维增多,接近正常皮肤组织结构。 5. BMSCs对皮肤光老化治疗作用的机制研究 紫外线照射2周后,在豚鼠皮肤照射区局部多点皮内注射DAPI标记的BMSCs,激光共聚焦显微镜下观察发现,DAPI标记的BMSCs富集在光老化皮肤组织中;无论是照射两周后给予BMSCs继续治疗至60天,还是照射60天接受BMSCs治疗30天,PCR检测模型豚鼠受照射区域皮肤组织内均含有供体雄性豚鼠Y染色体性别决定区SRY基因;免疫组化结果显示,模型组及自然恢复组与对照组相比,Ⅰ型胶原蛋白的表达显著增加(p0.05);BMSCs预防治疗组及BMSCs治疗组与模型组相比,Ⅰ型胶原蛋白的表达量减少,接近正常对照组(p0.05);天狼星红染色可见,模型组及自然恢复组Ⅰ型胶原显著增多、Ⅲ型胶原减少,BMSCs预防治疗组及BMSCs治疗组Ⅰ型胶原显著减少,Ⅲ型胶原增多;PCR扩增Y染色体性别决定区SRY基因,结果显示,BMSCs预防治疗组和治疗组在500bp附近出现目的基因带,其余各组无此目的基因出现;取上述豚鼠皮肤光老化组织匀浆检测IL-1、IL-6和TNF-α,模型组及自然恢复组IL-1、IL-6和TNF-α均高于对照组,差异有显著性(p0.01);与模型组及自然恢复组比较,BMSCs预防治疗组及BMSCs治疗组,三种因子的量下降,差异有统计学意义(p0.01)。 结论: 1.本实验体外成功分离纯化并扩增BMSCs;反复传代后仍能保持其原有的形态特点和分化能力,显示其具有干细胞的特征;低密度接种能获得比高密度接种更多的细胞量及克隆数,证实其具有很强的增殖力。 2.紫外线照射60天,豚鼠皮肤出现皱纹、色素沉着、皮肤增厚及胶原增多且排列紊乱,证实已经成功建立豚鼠皮肤光老化动物模型。 3.本实验结果证实, BMSCs能够延缓皮肤光老化的发展进程,对光老化的发生具有预防作用。 4. BMSCs对皮肤光老化具有治疗作用。 5. BMSCs注入模型豚鼠后可以富集在光老化皮肤区域,提示BMSCs可能通过在损伤组织内定居对光老化起修复作用,是BMSCs对光老化修复作用的可能机制之一。 6. BMSCs可能通过对光老化皮肤中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的调控,来达到对光老化的治疗作用。 7.BMSCs注入光老化皮肤后对IL-1、IL-6和TNF-α等细胞因子的影响,也可能是BMSCs对光老化治疗作用的机制之一。 8.无论是照射两周后给予BMSCs继续治疗至60天,还是照射60天接受BMSCs治疗30天,PCR检测模型豚鼠受照射区域皮肤组织内均含有供体雄性豚鼠Y染色体性别决定区SRY基因。 创新点: 1.本研究将BMSCs应用于皮肤光老化的治疗中; 2.观察到BMSCs可以延缓皮肤光老化的进程; 3.观察到BMSCs对皮肤光老化具有治疗作用; 4.探讨了BMSCs对皮肤光老化治疗作用的机制。
【图文】：

图 1 豚鼠原代 BMSCs（100×） 图 2 培养第二代的豚鼠 BMSCs（100×）图 3 培养第三代的豚鼠 BMSCs（100×）3.2 豚鼠 BMSCs 细胞生长曲线以 MTT 法对生长良好的 1、3、5 代细胞分别连续六天计数，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，，描绘生长曲线（表 1、图 4）。结果显示，绘制的生长曲线呈 S 型，BMSCs 在接种后第 1-2 天为潜伏期，随后便快速增殖，进入对数生长期，持续 2-3 天，此后细胞增长逐渐减缓，进入平台

图 1 豚鼠原代 BMSCs（100×） 图 2 培养第二代的豚鼠 BMSCs（100×）图 3 培养第三代的豚鼠 BMSCs（100×）3.2 豚鼠 BMSCs 细胞生长曲线以 MTT 法对生长良好的 1、3、5 代细胞分别连续六天计数，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘生长曲线（表 1、图 4）。结果显示，绘制的生长曲线呈 S 型，BMSCs 在接种后第 1-2 天为潜伏期，随后便快速增殖，进入对数生长期，持续 2-3 天，此后细胞增长逐渐减缓，进入平台
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R770.5;R751

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本文编号：2592583