来自白癜风患者的诱导多功能干细胞（iPS）分化的黑素细胞构建三维皮肤模型的研究

发布时间：2020-04-05 18:06

【摘要】：目的:使用白癜风患者正常组织处的角质形成细胞构建表皮层,成纤维细胞构建真皮层以及含有具有白癜风患者特异性的诱导黑素细胞在体外运用三维(3D)细胞共培养技术构建的皮肤模型。方法:1.从一个正常人中提取三种皮肤原代细胞构建具有个体化的正常皮肤模型。2.取白癜风病人色素减退的皮损组织后分离出原代成纤维细胞和角质形成细胞并进行培养,运用诱导多功能干细胞技术重编程为多功能干细胞(iPSC)后诱导分化为黑素细胞,将其与原代角质形成细胞在体外进行共培养。3.从白癜风患者正常皮损出提取皮肤原代细胞以及和上述的诱导黑素细胞构建体外色素皮肤模型。结果:1.使用Alvetex Scaffold小室构建的个体化正常皮肤模型的具有角质层,角化不明显,真皮层不明显;使用原代成纤维细胞和HaCaT细胞株可以成功构建全厚度的体外皮肤模型。2.黑素细胞在三维体外皮肤模型下DOPA染色呈现为阳性,提示具有酪氨酸酶活性。3.使用I型鼠尾胶原作为细胞外基质可以构建正常具有个体化皮层模型。4.诱导黑素细胞的生长形状和黑素基因相关蛋白表达与原代黑素细胞相似。5.诱导黑素细胞和原代角质形成细胞共培养中其黑素小体具有转运功能。6.含有白癜风患者特异性的诱导黑素细胞在体外皮肤模型中酪氨酸酶活性有阳性结果。结论:使用原代的表皮和真皮细胞运用体外三维(3D)共培养技术可以构建体外全厚度皮肤模型;由白癜风患者皮肤皮损处来源的诱导多功能干细胞(iPSC)诱导出的黑素细胞在形态、蛋白表达、酪氨酸酶活性以及黑素小体转运功能上都与正常黑素细胞相似;使用白癜风患者特异性的诱导黑素细胞,包含其患者正常的角质形成细胞构建的表皮层和成纤维细胞构建的真皮层的体外皮肤模型,可以对后期构建一个个体化的白癜风皮肤模型奠定了基础。
【图文】：

2.3 实验结果2.3.1 三种原代细胞的形态学观察原代成纤维细胞培养 15 天左右后，全部换液，在倒置显微镜下可观察细胞贴附与培养皿底，胞核较大，细胞的形状类似为纺锤形扁平状。继续培养后该细胞生长速度增快，形态均一，长满后传代。传代后的细胞形态无明显改变（如图A），原代黑素细胞培养 7-10 天后，在倒置显微镜下观察细胞有树枝状的分叉，树突细长，折光性强，细胞生长速度一般，形态较均一（如图 B），，细胞长满皿底 70%进行传代，传代后细胞形态变化不大，随着传代次数增多，黑素细胞胞核变扁圆，中间有空泡，轴突增多，折光性差，原代角质形成细胞培养 10 天左右可以看到胞核扁平，形态均一（如图 C），每天换液可发现死细胞较多，传代后细胞状态可，细胞可发生鹅软石样叠加生长。

来自白癜风患者的诱导多功能干细胞（iPSC）分化的黑素细胞构建三维皮肤模型的研究2.3.2 运用Alvetex Scaffold 小室构建体外皮肤模型2.3.2.1 不使用 I 型鼠尾胶原作为基质层构建全厚度皮肤模型使用 Alvetex Scaffold 小室将成纤维细胞计数后直接接种上培养 1 周，组织包埋切片后可以看到成纤维细胞均匀散在 Alvetex 的孔隙中构成真皮层（如图 A），构建好真皮层后将 HaCaT 计数后接种在真皮层上培养 1 周，石蜡包埋切片后可看见完整的真皮层的同时也有完整的角质层，角质层细胞胞核均一，胞质均一， 未有明显角化（如图 B）。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R758.41

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本文编号：2615346