雷帕霉素调控原肌球蛋白（TPMs）在银屑病中的作用机制

发布时间：2020-04-07 04:37

【摘要】：研究背景和目的银屑病(psoriasis)是一种由免疫介导的多基因相关慢性炎症性皮肤病,可由感染、外伤、药物及环境等多种因素诱发,以表皮角质形成细胞(keratinocyte cell,KC)发生过度增殖和异常分化,真皮先天性和获得性的炎性浸润,毛细血管迂曲、新生为主要病理特征。银屑病确切的病因和发病机制至今仍未完全阐明,病程长,易复发,难治愈,临床上许多治疗银屑病的方法虽然可以有效的缓解病情,但是仍不能防止银屑病复发。因此,深入研究银屑病的发病机制,并在此基础上寻找新的有效的银屑病治疗靶点,成为当今世界皮肤科领域研究的热点和难点。银屑病的病因和发病机制异常复杂。研究证明,银屑病病理生理过程中涉及到炎症、免疫紊乱、细胞增殖与凋亡异常、细胞内信号传导通路激活等多方面因素;其中免疫失衡是发病机制的重要环节,T细胞、KC、γ δ T细胞、树突状细胞(Dendritic Cells,DC)、中性粒细胞、自然杀伤性T细胞等多种细胞成分分泌一系列细胞因子、趋化因子,介导细胞内信号转导通路的活化,从而在KC、固有免疫细胞、T淋巴细胞之间相互作用,产生级联放大效应及恶性循环,最终协同作用到皮损局部KC,诱导KC发生过度增殖和异常分化,导致银屑病皮损炎症反应发生。原肌球蛋白(tropomyosin,TPMs)广泛分布于各种真核细胞中,是通过与肌动蛋白结合而稳定微丝的细胞骨架蛋白亚型,与细胞转移、形态发生和调节肌动蛋白丝等过程有关。TPMs家族分为两大类,高分子量原肌球蛋白(HMW-TPMs)和低分子量(LMW-TPMs)原肌球蛋白。目前研究认为TPMs可以被Ras癌基因调节,当Ras癌基因激活时,TPMs表达下调。HMW-TPMs中的TPM1被视为新的抑癌基因,在多种实体肿瘤组织中表达下调,如乳腺癌、膀胱癌、神经母细胞瘤等,且HMW-TPMs可调节肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,已有报道证明,在与正常成人健康皮肤组织相比,银屑病皮损组织中原肌球蛋白的表达明显下调。提示TPMs可能参与银屑病的发病机制。此外,同为Ras-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路中的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)为重要的下游靶蛋白,研究证明,mTOR信号通路参与调节细胞增殖、分化和凋亡,银屑病皮损中mTOR信号通路激活,参与银屑病的发生和发展。mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,mTOR抑制剂)又称为西罗莫司,最初被作为抗真菌药及免疫抑制剂,已用于抗移植物排斥反应、抗肿瘤、血管性疾病的治疗,近年在糖尿病治疗、神经元的保护等方面的研究增多。在皮肤科涉及黑素瘤、结节性硬化症、脉管畸形多方面治疗作用。雷帕霉素抗肿瘤的作用主要是影响肿瘤细胞的生长、异常增殖,已有研究报道发现应用雷帕霉素治疗银屑病有效,应与mTOR通路有关,但其具体机制仍需进一步研究,mTOR和TPMs同受Ras-PI3K信号通路的调节,同样与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移有关,二者在银屑病发病中的作用尚未可知,目前未见国内外有关报道。为探讨雷帕霉素调控TPMs及其在银屑病发病中的作用,本课题研究从mRNA及蛋白水平检测TPMs在正常健康皮肤组织、银屑病皮损及非皮损皮肤组织中的表达,筛选出表达差异的TPMs。目前的研究结果表明表观遗传改变,包括DNA甲基化、组蛋白修饰和乙醇化等可能在银屑病中起重要作用,已有研究发现银屑病皮损伴有DNA甲基化改变,涉及银屑病发病的表观遗传过程,且发现这些差异主要发生在皮损角质形成细胞中,但银屑病的表观遗传改变及其发病机制尚未完全阐明,在本实验中进一步应用甲基化特异性PCR检测了差异表达的TPMs的甲基化水平,从而探讨TPMs及其表观遗传修饰在银屑病发病中的作用机制;在此基础上,采用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激永生化人角质形成细胞(Hacat细胞)及人表皮角质形成细胞(HEK)构建银屑病细胞模型,分别检测了雷帕霉素干预前后TPMs的表达及甲基化程度、胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和mTOR的磷酸化水平,同时观察雷帕霉素对角质形成细胞增殖、细胞骨架、周期分布的作用;并从银屑病动物模型中进一步验证,以研究雷帕霉素与TPMs在银屑病发病及治疗中的作用,同时为雷帕霉素应用于临床治疗银屑病提供基础研究。第一部分健康人皮肤及斑块型银屑病皮损中TPMs的表达及甲基化水平研究目的观察TPMs mRNA在健康对照皮肤组织、斑块型银屑病皮损及非皮损组织中的表达水平,筛选出表达差异的TPMs,并探讨其蛋白表达水平及甲基化水平。研究方法1.标本收集:收集2015年6月-2016年6月山东大学千佛山医院皮肤科斑块型银屑病患者留存的皮损及非皮损组织各20例。诊断标准根据《中国银屑病治疗指南》(中华医学会皮肤性病分会银屑病学组,2008版)。所有患者符合入组标准(详见正文)。另选取本院整形外科留取的健康对照皮肤标本20例,在年龄、性别、取材部位上与斑块型银屑病组相匹配;2.采用实时定量荧光PCR(real-time PCR)的方法检测TPMs mRNA在斑块型银屑病皮损、非皮损组织及健康对照皮肤组织中的表达情况,筛选出表达差异者;同时利用HE染色观察银屑病皮损及健康对照皮肤组织的表皮增殖程度;3.用免疫组化二步法进一步检测斑块型银屑病皮损、非皮损和健康对照组织中差异表达的TPMs的蛋白表达水平;4.利用甲基化特异性PCR检测差异表达的TPMs启动子的甲基化水平。结果1.real-time PCR结果显示,与健康对照组相比,TPM1和TPM2的mRNA表达水平在斑块型银屑病皮损及非皮损组织中均显著下调,差异具有统计学意义(P0.001),且斑块型银屑病皮损组比非皮损组TPM1和TPM2表达水平也明显下调(P0.01),而TPM3和TPM4的mRNA表达水平则无明显差异;2.HE染色观察银屑病皮损组织的表皮层显著厚于健康对照和非皮损组织;3.免疫组化结果:与健康对照组相比,斑块型银屑病皮损及非皮损组织中TPM1和TPM2蛋白表达降低;4.甲基化特异性PCR检测出与健康对照组及非皮损组相比,斑块型银屑病皮损组织中TPM1和TPM2的启动子发生甲基。结论:1.TPM1和TPM2的mRNA及蛋白表达水平在斑块型银屑病皮损中表达明显下调2.TPM1和TPM2的启动子在斑块型银屑病皮损中发生甲基化第二部分雷帕霉素在银屑病细胞模型中对TPMs表达及细胞增殖的影响研究目的探讨在体外银屑病细胞模型中TPM1和TPM2的表达及雷帕霉素的调节作用,观察雷帕霉素对体外角质形成细胞增殖的影响,从而探讨雷帕霉素及TPMs参与银屑病发病中可能的作用。研究方法1.利用TNF-α诱导体外银屑病细胞模型;将Hacat细胞及HEK分别接种于24孔板中,浓度为1 × 104个细胞/孔,并在37 ℃C培养过夜。然后,将TNF-α(10 ng/ml)加入到每个孔中,刺激细胞。2.对银屑病细胞模型进行雷帕霉素处理;利用5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza)作为阳性对照,实验分组为:1)Hacat细胞(空白对照组,不加任何药物)2)Hacat 细胞+TNF-α(1 Ong/ml,1 小时)3)Hacat 细胞+TNF-α(l0ng/ml,1 小时)+ rapamycin(50 nM/L,1 小时)4)Hacat 细胞+TNF-α(10ng/ml,1 小时)+5-Aza(阳性对照,5 μM/L,1小时)5)HEK(空白对照组,不加任何药物)6)HEK+TNF-α(10ng/ml.1 小时)7)HEK+TNF-α(10ng/ml,1小时)+rapamycin(50 nM/L,1 小时)8)HEK+TNF-α(lOng/ml,1 小时)+5-Aza(阳性对照,5 μM/L,1 小时)3.应用real-time PCR检测各组TPM1和TPM2的mRNA表达水平;并用抗TPM1和抗TPM2的抗体进行免疫荧光检测TPM1和TPM2蛋白的表达水平;4.分别于24,48和72小时应用CCK8检测各组细胞的增殖情况,并采用EdU染色观察各组细胞的增殖情况;5.用鬼笔环肽(Phalloidin)及DAPI(细胞核)染色,检测各组细胞骨架分布情况;6.应用流式细胞仪检测各组细胞周期的分布情况,并统计三次实验结果做统计学处理;7.采用Western blot检测各组TPM1、TPM2的蛋白表达水平,并检测了信号通路中关键分子ERK1/2和mTOR的磷酸化水平;8.应用甲基化特异性PCR检测各组细胞TPM1和TPM2启动子的甲基化水平。结果1.在TNF-α刺激后,TPM1和TPM2mRNA的表达水平与空白对照组相比均显著下调,差异有统计学意义(P0.001),而雷帕霉素处理后Hacat和HEK的TPM1和TPM2 mRNA表达水平则较TNF-α组明显升高,差异有统计学意义(P0.05);2.免疫荧光发现应用TNF-α刺激细胞后,TPM1和TPM2的蛋白表达水平下调,而在TNF-α刺激的同时加入雷帕霉素,TPM1和TPM2的蛋白表达水平回升;3.TNF-α刺激24,48和72小时后,HEK和Hacat细胞的增殖水平显著增加(P0.001),而用雷帕霉素和TNF-α同时处理后,细胞的增殖较TNF-α组明显下降(P0.05,P0.00l),提示雷帕霉素可逆转TNF-α引起的细胞增殖;EdU染色结果中观察到与之一致的变化;4.发现在TNF-α刺激的Hacat和HEK细胞中细胞骨架均被破坏,而雷帕霉素处理后银屑病细胞模型中细胞骨架的结构恢复;5.发现TNF-α引起细胞周期中S期阻滞,与空白对照组比差异显著(P0.05),而雷帕霉素处理后则恢复细胞S期的分布,说明雷帕霉素调节银屑病细胞模型的细胞周期分布;6.TNF-α刺激下显著增加Hacat细胞及HEK中ERK1/2和mTOR的磷酸化水平,而雷帕霉素的处理则抑制ERK1/2及mTOR磷酸化水平;8.发现TNF-α刺激后TPM1和TPM2的启动子出现甲基化,而雷帕霉素处理后TPM1和TPM2的甲基化水平则显著下降。结论1.TNF-α诱导的银屑病细胞模型中TPM1和TPM2的表达水平下调2.雷帕霉素抑制TPM1和TPM2启动子的甲基化,逆转二者在银屑病细胞模型中的低表达3.雷帕霉素抑制体外银屑病细胞模型的细胞增殖,并且恢复细胞的S期分布4.雷帕霉素通过调控TPM1和TPM2恢复角质形成细胞骨架的完整性5.雷帕霉素抑制银屑病细胞模型中mTOR的磷酸化,并降低ERK1/2的磷酸化水平第三部分雷帕霉素对银屑病动物模型TPMs的调控作用研究目的利用小鼠模型进一步验证雷帕霉素调节TPMs在银屑病中的作用研究方法1.使用咪喹莫特(IMQ)制备小鼠银屑病模型,并用雷帕霉素、5-Aza干预,制备成四组动物模型;具体分组:①正常对照组(生理盐水组,6只);②银屑病模型组(IMQ组,背部脱毛后涂抹5%IMQ,62.5mg/cm2,每日1次,连续给药10天,6只);③雷帕霉素治疗组(IMQ+RAPA组,3.0mg/kg/体重,腹腔注射,每日1次,连续10天,6只);④5-杂氮脱氧胞苷对照组(IMQ +5-Za组,3.0 mg/kg/体重,腹腔注射,每日1次,连续10天,6只);2.利用PASI评分评价各组小鼠银屑病模型的构建;3.应用HE染色评价各组的表皮增殖程度;4.应用免疫组化及Western blot检测各组动物模型皮损组织中TPM1和TPM2的表达情况;5.应用Western blot检测各组动物模型皮损组织中磷酸化ERK1/2和磷酸化mTOR的表达水平;6.应用甲基化特异性PCR检测各组动物模型皮损组织中TPM1和TPM2的甲基化水平。结果1.IMQ诱导小鼠银屑病模型成功;2.应用HE染色发现,银屑病模型组小鼠皮肤的表皮层显著增厚,而雷帕霉素治疗组则较银屑病模型组有显著恢复变薄,表明雷帕霉素保护IMQ引起的表皮增殖;3.应用免疫组化及Western blot检测TPM1和TPM2在各组动物模型皮损中的表达,发现在银屑病模型组显著降低,而雷帕霉素治疗组的小鼠模型皮损中,TPM1和TPM2的表达水平则恢复上调;4.银屑病动物模型中ERK1/2和mTOR的磷酸化水平上调,而雷帕霉素的处理则抑制ERK1/2及mTOR磷酸化水平;5.在动物模型中,与前期实验一致,银屑病模型组TPM1和TPM2的甲基化水平显著增加,而雷帕霉素则抑制TPM1和TPM2的甲基化。结论1.雷帕霉素在IMQ诱发的小鼠银屑病模型中起保护作用2.TPM1和TPM2在银屑病动物模型皮损组织中的表达下调3.雷帕霉素抑制TPM1和TPM2启动子的甲基化,上调二者在银屑病动物模型中的表达水平
【图文】：

启动子序列,甲基化,启动子,二步法

ｔｐｍｉ逡逑ＴＰＭ２逡逑图１．邋３各组皮肤组织中ＴＰＭ１和ＴＰＭ２启动子的甲基化（甲基化ＰＣＲ，３例）逡逑根据ＴＰＭ１和ＴＰＭ２启动子序列设计甲基化引物进行甲基化ＰＣＲ检测，与正常逡逑对照组及银屑病非皮损组相比，银屑病皮损组织中ＴＰＭ１和ＴＰＭ２的启动子发．逡逑生甲基化（Ｍ表示甲基化）逡逑３４逡逑

启动子序列,甲基化,启动子

？：靠＿逡逑＼邋Ｌ＇．ｔ．逡逑图１．２各组皮肤组织中ＴＰＭ１和ＴＰＭ２的蛋白表达（免疫组化二步法，２００邋Ｘ邋）逡逑正常皮肤组织，银屑病皮损组织和非皮损组织；银屑病皮损和非皮损组织较正常逡逑皮肤组织比较ＴＰＭ１和ＴＰＭ２的蛋白表达水平降低逡逑ＭＵ邋ＭＵ邋ＭＵ邋Ｍ邋Ｕ邋Ｍ邋Ｕ邋ＭＵ邋Ｍ邋Ｕ邋Ｍ邋Ｕ邋Ｍ邋Ｕ邋Ｍ邋Ｕ邋Ｍ邋Ｕ逡逑ｔｐｍｉ逡逑ＴＰＭ２逡逑图１．邋３各组皮肤组织中ＴＰＭ１和ＴＰＭ２启动子的甲基化（甲基化ＰＣＲ，３例）逡逑根据ＴＰＭ１和ＴＰＭ２启动子序列设计甲基化引物进行甲基化ＰＣＲ检测，，与正常逡逑对照组及银屑病非皮损组相比，银屑病皮损组织中ＴＰＭ１和ＴＰＭ２的启动子发．逡逑生甲基化（Ｍ表示甲基化）逡逑３４逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R758.63

【参考文献】