甲硫氨酸硫氧化物还原酶A对氧化应激状态下黑素细胞活性的影响

发布时间：2020-04-11 22:57

【摘要】： 白癜风是一种常见的、以皮损处色素脱失为特点的慢性疾病,其发病机制尚不完全清楚。以往的研究发现其与遗传、自身免疫等有关,近年来氧化应激成为白癜风研究领域的一大热点。正常情况下,皮肤ROS的产生与清除处于动态平衡之中,而白癜风中这一平衡被打破。已证实多个外源性因素及多条内源性通路的紊乱导致了ROS的持续异常产生。在进展期白癜风患者表皮可检测到浓度范围为10-3 M的H_2O_2蓄积,远远高于生理浓度10-7 M -10-6 M。 ROS的作用靶之一是蛋白质中的氨基酸残基。其中含活性硫侧链的甲硫氨酸对氧化损伤尤为敏感,被氧化为甲硫氨酸硫氧化物。而甲硫氨酸硫氧化物还原酶(Methionine sulfoxide reductases, MSR)能逆转这一过程,参与甲硫氨酸的再生。该酶具有立体结构特异性,分为MSRA及MSRB。其中MSRA特异性地还原甲硫氨酸-S-硫氧化物,定位于细胞浆和线粒体;MSRB特异性地还原甲硫氨酸-R-硫氧化物。MSR是一个独特的抗氧化酶系统,它不仅参与氧化损伤的修复,同时也是ROS清道夫,在抗氧化防御、调控生物体寿命以及调节蛋白质功能等方面扮演着举足轻重的角色。 MSR是皮肤抗氧化网络的重要成员,角质形成细胞及黑素细胞均表达MSR,这对皮肤氧化-还原平衡及细胞内环境稳态的维持起着非常重要的作用。然而,新近文献报道白癜风中该酶系统严重受损:患者整个表皮,尤其是皮损区MSR的表达及活性显著降低,10~(-3) M的H_2O_2可使重组MSRA的活性下降85%。计算机模拟分析显示MSRA活性部位的甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸残基被氧化。 MSRA,这个独特的抗氧化酶,兼具修复蛋白质的氧化损伤及降低细胞内ROS水平的功能,我们推测MSRA表达水平的下降不利于氧化应激状态下黑素细胞的生存,会导致黑素细胞对氧化应激的敏感性增高,这可能是白癜风中黑素细胞丧失的机制之一。第一部分实验:MSRA特异的siRNA有效序列的筛选 1.主要方法用三对MSRA特异的siRNA瞬时转染人宫颈癌细胞系Hela,每次转染均分为空白对照组(不含siRNA),阴性对照组(转染阴性对照Non-targeting siRNA)及实验组(转染MSRA siRNA)。于转染后24h及48h分别行RT-PCR及Western blot检测MSRA被抑制的情况。 2.主要结果 RT-PCR及Western blot结果显示#111798 MSRA siRNA对靶基因的抑制效果最好。与阴性对照组相比,在内参照GAPDH表达水平一致的前提下,转染了#111798 MSRA siRNA的Hela细胞MSRA的mRNA及蛋白表达量均明显降低。 3.主要结论 RNAi技术为我们研究MSRA表达水平下降对处于氧化应激状态下黑素细胞活性的影响提供了可能。本部分实验筛选出了最有效的MSRA siRNA序列,为后续的实验打下基础。第二部分实验:MSRA对处于氧化应激状态下黑素细胞活性的影响 1.主要方法 #111798 MSRA siRNA瞬时转染永生化的人表皮黑素细胞系PIG1,于转染后48h及72h分别进行RT-PCR及Western blot检测黑素细胞中MSRA被抑制的情况。每次转染均设空白对照组、阴性对照组及实验组。用1mM的H_2O_2处理转染后的三组黑素细胞24h,检测细胞增殖活性。 2.主要结果 MSRA siRNA成功抑制了黑素细胞中MSRA的表达。MSRA表达水平的下降使得黑素细胞对氧化应激的敏感性增高,与空白对照组相比具有统计学意义。即使在无外源性H_2O_2时,MSRA表达被特异性抑制的黑素细胞活性较之空白对照组也显著降低。 3.主要结论我们的研究证实MSRA表达水平的下降导致导致黑素细胞对氧化应激的敏感性增高,这可能是白癜风中黑素细胞丧失的机制之一。此外,即使在无外源性氧化应激时,MSRA的表达被特异性抑制后也不利于黑素细胞的生存,提示其在黑素细胞正常功能中的重要作用。白癜风中包括抗氧化系统、黑素合成及代谢系统、6BH4合成/再循环系统等多个方面均遭受ROS的不利影响。我们推测在白癜风中存在着一个恶性循环:H_2O_2因氧化酶活性部位的氨基酸残基而使上述系统中的关键酶失活,紊乱的各条通路导致清除ROS的能力下降及内源性ROS的异常产生。MSRA的表达水平在白癜风患者中显著降低,且MSRA自身也因H_2O_2氧化而失活,这意味着一方面关键酶的氧化损伤得不到有效的修复,另一方面会使细胞内ROS水平升高及线粒体膜电位下降,从而进一步加重了氧化应激。内源性及外源性H_2O_2最终导致黑素细胞功能丧失,甚至死亡。大量表达MSRA可保护处于氧化应激状态下的多种细胞,提示其对白癜风具有预防、治疗潜能。
【图文】：

转染,室温,避光,稀释度

次日室温下 TBST 摇洗 3×5min；加入羊抗兔荧光二抗（TBST 稀释，，稀释度 1：20000），慢摇动 1h；避光室温 TBST 摇洗 3×5min；扫膜机扫膜。转染 Hela 细胞 24h 后 RT-PCR 结果CR 扩增 MSRA 和 GAPDH，得到预期目的条带大小分。在内参照 GAPDH 表达水平一致的情况下，与阴rgeting）相比，MSRAsiRNA 干涉组（#111797、#111798带明显减弱，尤其是#111798、#111799 两组。

细胞转染

图2Hela细胞转染MSRAsiRNA48h 后Westernblot 结果皮肤是机体与环境接触的重要界面，外界的各种物理、化染物，都可以通过特定的反应不断产生一系列的活性氧化 ROS。皮肤同时也具备了强大的抗氧化防御系统以拮抗响，维持氧化-还原平衡。其中 MSR 因为可以逆转含硫氨过程，参与氧化损伤修复而成为皮肤抗氧化网络中的一越来越多的文献表明白癜风发病与皮肤的氧化应激密切中，持续异常蓄积的 H2O2因氧化活性部位的氨基酸残基、蛋白质、辅助因子、肽段失活，涉及到造成抗氧化系统
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R758.41

【引证文献】