CD100促进大疱性类天疱疮致病性自身抗体产生的作用及其机制研究

发布时间：2020-04-12 11:22

【摘要】：背景:大疱性类天疱疮(BP)是皮肤科常见的一种自身免疫性水疱病,病理特点为表皮下水疱,皮损有嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎细胞浸润和基底膜带自身抗体和补体的沉积。自身反应性B细胞活化后产生针对真表皮基底膜带半桥粒抗原(BP180和BP230)的致病性自身抗体是BP发病的关键环节。目前认为在体液免疫中,自身抗体的产生依赖于B细胞受到抗原刺激后,在辅助性T细胞(Th)的辅助下发生活化、增殖,进而分化为浆细胞,从而合成多种免疫球蛋白(Ig)。在自身抗体产生的过程中,一方面B细胞表面受体(BCR)捕获抗原为B细胞活化提供了第一信号,另一方面Th细胞与B细胞的相互作用为B细胞的活化提供了必不可少的第二信号。与此同时,B细胞膜表面存在协同刺激分子,共同参与调控B细胞的活化。因此,探究影响B细胞活化的协同刺激分子,有助于深入解析B细胞活化和抗体生成的关键环节,对阐明BP发病机制并探讨新的治疗策略具有重要意义。CD100(Semaphorin 4D)属于信号素(Semaphorin)家族成员之一,是首个被发现具有免疫调节功能的信号素蛋白,为I型膜分子。CD100分子是一种细胞膜表面蛋白,全长150-kDa,可被多种蛋白水解酶剪切后从细胞膜表面脱落,形成120-kDa的游离型分子(sCD100),并且这种游离形式的CD100具有和膜型CD100同样的生物活性。CD100的受体包括CD72,Plexin-B1和Plexin-B2,其中CD72主要表达于B淋巴细胞表面。研究表明CD72是B淋巴细胞表面重要的负向协同刺激分子之一,可通过负向调控BCR信号抑制B淋巴细胞的活化和增殖。CD100与B细胞表面的CD72结合可“关闭”CD72对BCR的抑制信号,参与B细胞活化、增殖、分化和成熟。因此我们提出如下假说:BP患者血清及疱液中的sCD100可以通过作用于B细胞表面的负向协同刺激分子CD72,促进B细胞的活化、增殖和分化,进而促进致病性自身抗体产生,参与BP的发生与发展。目的:1.分析BP患者血清、疱液及局部皮损中CD100的表达情况,明确CD100与BP的相关性;2.明确CD100对BP患者致病性自身抗体产生的作用,并阐明其具体机制。方法:1.收集BP患者血清、疱液和皮损组织,利用ELISA、Western blot、免疫组化及组织免疫荧光技术检测CD100在BP患者血清、疱液及局部皮损中的表达情况。2.评估BP患者BPDAI评分,测定BP患者抗BP180及抗BP230的抗体滴度,作为反映患者病情活动性和严重程度的临床依据,进而与BP患者血清和疱液中的sCD100的浓度进行病情相关性分析。3.用不同浓度CD100重组蛋白刺激BP患者PBMC,于不同时间节点收集刺激后细胞培养上清,ELISA检测细胞培养上清抗BP180抗体滴度,筛选CD100重组蛋白刺激PBMC产生抗体的最佳浓度及刺激时间;在此基础上,用CD100重组蛋白最佳浓度刺激BP患者PBMC,于最佳刺激时间ELISA检测细胞培养上清抗BP180及抗体BP230抗体滴度,明确CD100对BP患者致病性自身抗体产生的作用。4.用CD100重组蛋白刺激BP患者PBMC,离心收集细胞沉淀,流式细胞术检测CD100刺激前后B细胞的分化情况;胞内细胞因子染色及流式细胞术筛选CD100刺激PBMC活化的下游通路;小分子通路抑制剂验证CD100活化B细胞的下游通路。5.收集BP患者PBMC、粒细胞、疱液细胞,流式细胞术检测不同细胞亚群膜表面CD100表达情况,明确BP患者游离型sCD100的细胞来源;使用不同蛋白水解酶处理粒细胞,明确剪切细胞膜表面CD100的蛋白水解酶,并使用蛋白水解酶特异性抑制剂验证其剪切功能。结果:1.BP患者血清和疱液中的sCD100水平较健康对照组显著升高,并与BP患者的疾病严重程度及活动性呈正相关;免疫组化、组织免疫荧光结果显示,BP患者表皮下水疱及真皮浅层血管周围有大量表达CD100嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎细胞浸润。2.CD100重组蛋白可诱导BP180~+BP230~-的患者PBMC产生抗BP180抗体,诱导BP180~+BP230~+的患者PBMC产生抗BP180和BP230抗体,而CD100抗体可显著抑制CD100蛋白刺激PBMC产生致病性自身抗体。3.CD100重组蛋白通过Akt/NF-κB/Erk通路活化PBMC产生致病性自身抗体,Akt/NF-κB/Erk的小分子抑制剂可显著抑制CD100重组蛋白刺激PBMC产生致病性自身抗体。4.CD100重组蛋白可刺激PBMC中CD19~+CD138~-B细胞向CD19~+CD138~+浆母细胞分化。5.BP患者血清及疱液中高水平sCD100来源于ADAM10蛋白水解酶对CD15~+粒细胞膜表面CD100的剪切。结论:在BP发病过程中,ADAM10剪切BP患者CD15~+细胞表面CD100,是BP患者血清和疱液中高水平sCD100的重要来源。升高的sCD100通过与B细胞表面CD72结合,活化Akt/NF-κB/Erk信号通路,诱导CD19~+CD138~-初始B细胞向具备抗体分泌功能的CD19~+CD138~+浆母细胞分化,导致抗BP180及抗BP230抗体的产生,进而引发皮肤免疫损伤。我们的研究首次发现BP患者血清及疱液中存在高水平的sCD100,并且明确了sCD100来源于ADAM10对CD15~+粒细胞的剪切作用,证实了CD100参与BP致病性自身抗体的产生。研究结果丰富了BP致病性自身抗体产生的免疫学机制,为探索BP新的治疗策略提供理论基础。
【图文】：

直接免疫荧光,病理

类天疱疮概述性类天疱疮(BP)是一种常见的自身免疫性大疱性皮肤病，Lever BP 是一种不同于天疱疮和疱疹样皮炎的独立性疾病[1]。BP 好统计数据显示每年新发病例约为 2.4-42.8 例/100 万人[2-5]。中国为 12.9%，低于欧洲的 19%—41%[6,7]。BP 临床表现为水肿性红正常皮肤或水肿性红斑基础上出现水疱、大疱和血疱，疱壁紧张图 1.A）；BP 组织病理学特点为表皮下水疱形成，疱内及真皮浅细胞为主的炎性细胞浸润（图1.B）；直接免疫荧光（DIF）可见基膜或）C3 呈均质或线状沉积（图 1.C-D）；盐裂间接免疫荧光（IIF者血清表现为抗 BMZ 的 IgG 沉积于表皮侧[8]。BP 病情慢性迁患者的生活质量和身心健康造成极大影响，但其发病机制尚未完赖于系统应用糖皮质激素和免疫抑制剂，尚缺乏特异性治疗手段P 发病机制，寻找潜在的特异性治疗靶点一直是学科领域关注的

连接蛋白,表皮

图 2 真表皮连接蛋白结构（Schmidt E. Lancet, 2013）[3]理因素。目前文献已报道的与 BP 发病相关的物理因素有紫外线（U和紫外线 A（PUVA）、放射疗法，热或电灼伤以及外科手术，这些物理接损伤 BMZ 区域的蛋白，改变该区域蛋白的正常抗原结构，导致致病和暴露因素，进而引起的泛发全身或仅局限于局部的皮肤免疫损伤[2染因素。有研究认为感染可以诱发 BP，尤其是疱疹病毒感染，因其损大量存在，而被认为与 BP 发生发展密切相关。相关研究认为病毒插入宿主细胞，或病毒释放的游离抗原与宿主细胞的蛋白碎片相融合好与宿主细胞有相似的抗原表位，以上原因可导致在机体暗藏的致病[24]。自身抗原的提呈
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R758.66

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