脐血来源Langerhans细胞的分化特征及对菌群代谢产物IAId的应答和机制研究

发布时间：2020-04-29 18:42

【摘要】：Langerhans细胞(LC)是表皮重要的抗原递呈细胞,在调节皮肤免疫应答中具有关键作用。LCs的发育、分化及其在感知外界环境刺激中所发挥的功能尚不十分明确,本课题借助脐血CD34+细胞来源LC模型,研究LCs的分化特征及对皮肤菌群代谢产物的应答反应,主要分为两大部分。在第一部分研究中,我们针对脐血来源LCs衍生中出现的CD1a+CD207-、CD1a+CD207lo和CD1ahiCD207hi三个亚群,采用流式细胞技术检测和分析不同亚群的表型分子,初步发现由CD1a+CD207-DCs分化而来的CD1a+CD207loLCs和CD1ahiCD207hiLCs分别表现出皮肤定居LC(cLC)和迁移LC(mLC)样的表型和功能特征。借助户尘螨抗原Derp2刺激体系,通过激光共聚焦共定位和流式检测明确了 CD207介导LCs对Derp2的特异性结合和吞噬,进一步分析发现CD207hiLCs在抗原识别和摄取中的主导作用。我们同时对脐血来源LCs进行单细胞测序分析,在转录组水平证实LC群体的异质性;通过聚类分析将LCs分为CD207+Type1 LCs和CD207lo/-Type2 LCs两大类群,针对差异表达基因的分析提示两群LCs分别具有不同的功能,与流式分群鉴定的CD207hiLCs和CD207loLCs存在对应关系;CD207+Type1 LCs和CD207lo/-Type2 LCs的分化分别受转录因子PU.1和Id2的调控。本研究在转录组和蛋白水平揭示了脐血来源LC的异质性,所发现的具有不同表型和功能特征的LC亚群有助于我们更好的研究LC的发育、分化和功能。特应性皮炎(AD)是常见的慢性复发性炎症性皮肤病,菌群及其代谢产物参与调节AD发病。我们前期发现AD患者皮肤表面菌群代谢产物吲哚-3-甲醛(IAId)浓度明显降低。IAId参与调控皮肤炎症的细胞和分子机制尚不完全明确,在第二部分研究中,我们利用脐血LC模型探索IAId通过LCs调节免疫反应的作用和机制。利用流式、RT-qPCR和ELISA方法检测发现IAId可诱导LCs表面成熟活化标志物表达升高,合成分泌IL-12p70和抑制性细胞因子IL-10,下调促炎因子TNF-α和IL-4的表达。在LC-CD4+T细胞共培养体系中,通过流式和CBA方法检测CD4+T细胞增殖和极化情况,发现IAId活化后的LCs抑制T细胞增殖,诱导IL-10和IFN-y分泌,抑制IL-6产生,平衡Th1/Th2反应。进一步研究发现IAId可引起芳香烃受体(AhR)靶基因CYPIA1、CYPIB1和免疫抑制酶吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达升高,抑制AhR活化可降低IL-10和IL-10受体表达,表明AhR通路是IAId发挥作用的关键途径。IAId还可在mRNA和蛋白水平下调高亲和力IgE受体(FcεRI)的表达,参与发挥负向调节作用。通过AhR抑制剂和小干扰RNA转染实验,以及IL-10激活和阻断实验,我们初步明确AhR的活化是调控FcεRI表达的主要机制。此外,免疫共沉淀结果表明IAId还可增强FcεRI泛素化水平,从而加速蛋白降解。我们首次从LC角度研究菌群代谢产物IAId参与调节免疫炎症的作用和机制,有望为通过调控皮肤菌群代谢产物来治疗AD等皮肤病提供新思路。
【图文】：

逦北京协和医学院博士学位论文逦逡逑种ＤＣ亚群始终存在，且相对比例发生变化，ＣＤｌａ＋ＣＤ２０７＿ＤＣｓ比例逐渐减少，而逡逑ＣＤｌａ＋ＣＤ２０７ｌＱＬＣｓ和ＣＤｌａｈｉＣＤ２０７ｈｉＬＣｓ比例逐渐增加，至诱导后期逡逑ＣＤｌａ＋ＣＤ２０７ｌａＬＣｓ分群更加明显。逡逑

４．２不同ＤＣ亚群的表型特征：逡逑流式细胞仪检测诱导至１２？１５天的不同ＤＣ亚群细胞表面８个关键的ＤＣ相关逡逑分子标记，根据图２画门方法分别分析３种ＤＣ亚群ＣＤ邋１邋ａ＋ＣＤ２０ＴＤＣ邋（简称Ｎｅｇ）、逡逑ＣＤｌａ＋ＣＤ２０７ｌｏＬＣ邋（简称邋Ｌｏｗ）和邋ＣＤｌａｈｉＣＤ２０７ｈｉＬＣ邋（简称邋Ｈｉｇｈ）上表型分子的表达逡逑情况。ＣＤｌｌｃ、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－４邋和邋ＦｃｓＲＩ邋在邋３邋个亚群中均有不逡逑同程度的表达，，其中ＣＤｌｌｃ在Ｎｅｇ群表达较高，Ｈｉｇｈ群表达最低（ＮｅｇｖｓＨｉｇｈ：逡逑尸＜０．０５）；邋ＥｐＣＡＭ在Ｈｉｇｈ群较高表达，Ｌｏｗ群表达较Ｈｉｇｈ群减少，Ｎｅｇ群呈低逡逑表达（ＮｅｇｖｓＨｉｇｈ：尸＜０．０１；邋ＬｏｗｖｓＨｉｇｈ：尸＜０．０１）；邋Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ邋在邋Ｈｉｇｈ邋群呈邋９０％逡逑以上高表达，在Ｌｏｗ群和Ｎｅｇ群上表达依次减弱（Ｎｅｇ邋ｖｓ邋Ｈｉｇｈ：邋／＾Ｏ．ＯＳ；邋Ｌｏｗ邋ｖｓ逡逑Ｈｉｇｈ：尸＜０．０５）；邋ＴＬＲ－２在Ｎｅｇ群和Ｌｏｗ群均表达较高，Ｈｉｇｈ群表达较低，但ＭＦＩ逡逑水平无显著差异；ＴＬＲ－４在Ｎｅｇ、Ｌｏｗ和Ｈｉｇｈ群表达呈逐渐下降趋势，Ｈｉｇｈ群呈逡逑低表达，但ＭＦＩ水平无显著差异；ＦｃｓＲＩ在Ｎｅｇ、Ｌｏｗ和Ｈｉｇｈ群表达逐渐升高，在逡逑Ｎｅｇ群表达较低
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R751

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本文编号：2644881