GINS2基因在恶性黑素瘤中的表达情况及GINS2-shRNA重组慢病毒表达载体的构建

发布时间：2020-05-04 11:52

【摘要】：目的:检验GINS2基因在恶性黑素瘤(MM)中的表达情况,构建靶向GINS2 sh RNA慢病毒表达载体并鉴定,为MM的基因靶向治疗提供依据。方法:1、采用免疫组化染色对MM和癌旁组织中GINS2的表达进行分析,q PCR检测人侵袭性脉络膜黑素瘤细胞株(MUM-2C)及人恶性黑素瘤细胞株(A375)GINS2基因表达情况;2、合成GINS2-sh RNA序列与慢病毒载体GV115接合,进行慢病毒包装和质量测评;3、运用GINS2-sh RNA慢病毒转染A375细胞株,通过q PCR技术检测sh GINS2组及阴性对照组GINS2基因m RNA的表达情况;Western-blot检测sh GINS2组及阴性对照组GINS2蛋白的表达水平,以验证转染效果。结果:1、通过免疫组化染色示:MM组织中GINS2的表达量相比于癌旁组织明显上升,差异有显著性(P0.05);q PCR检测示:GINS2在MUM-2C细胞及A375细胞中均高丰度表达(ΔCt值≤12)。2、成功合成并鉴定GINS2-sh RNA慢病毒表达载体。3、GINS2-shRNA慢病毒转染A375细胞株后qPCR检测示:shGINS2组中GINS2基因m RNA表达量明显低于sh Ctrl组,差异具有极显著性(P0.01);Western blot检测示:sh GINS2组中GINS2蛋白含量明显低于sh Ctrl组。结论:1、GINS2基因在MM组织及细胞中的表达均明显增高;2、成功构建了GINS2-sh RNA慢病毒表达载体,且成功转染A375细胞株,使GINS2基因的m RNA及蛋白表达均明显下降,证实GINS2-sh RNA重组慢病毒表达载体构建成功,为进一步研究该基因在MM发生发展中的作用奠定基础。
【图文】：

图 1 GV115慢病毒载体Fig 1 GV115 Lentiviral vector酶切体系放入RNase free离心管1 μg/μL) 2μLrt Buffer 5μL0 U/μL) 1μL10 U/μL) 0.2μL水将体系配置为50μL。37℃酶切3 h，，对载体酶切产物进行琼收目的条带。2-shRNA慢病毒载体构建性化载体与oligoDNA 序列连接

图 2 慢病毒包装与质量检测流程Fig 2 lentivirus packaging process染细胞的人恶性黑素瘤A375细胞株进行慢病毒感染。通过观测转染程度，当荧光率达到70%且细胞汇合度达到80%左右胞进行抗生素筛选48h，收集细胞汇合度达到80%左右的使用未包装GINS2-shRNA重组慢病毒质粒慢病毒作为阴素瘤A375细胞株慢病毒感染与检测：对数生长期的A375细胞株细胞胰酶消化，完全培养基制液，将5mL细胞悬液置于T25细胞培养瓶。继续培养保证0%左右。实验结果，选定 MOI 值 10 转染慢病毒，根据慢病毒产
【学位授予单位】：内蒙古医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.5

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本文编号：2648498