白癜风相关黑素细胞膜抗原的分析及纯化

发布时间：2020-05-08 02:52

【摘要】： 背景白癜风是一种常见的色素障碍性皮肤病，近些年发病率有明显增加的趋势，其病因及发病机理至今尚不明确。表皮黑素细胞主要被累及，毛囊内的黑素细胞也可有一定程度的受累，迄今黑素细胞破坏的机制尚未完全阐明，目前有自身免疫学说、遗传学说、神经学说、黑素细胞学说和角质形成细胞功能异常学说，但单一学说难以全面解释清楚，目前认为本病是一种多因素综合作用导致的疾病。大多数的研究倾向于自身免疫学说，近些年组织病理研究显示：白斑处表皮黑素细胞消失，活动性白斑边缘的真皮内有淋巴细胞浸润，另外许多学者用不同的方法证实白癜风患者血清中含有抗黑素细胞的自身抗体，，且抗体滴度与病情活动性密切相关。本课题组曾用免疫组化和丫啶橙/溴化乙锭染色法验证了白癜风血清中存在抗黑素细胞IgM、I8G抗体及血清IgG介导的补体反应对正常黑素细胞具有毒性作用。目前仅明确了其中几种与白癜风相关的黑素细胞胞浆抗原，如酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)及酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)，胞膜抗原则一直未被明确。尽管自身免疫性疾病的病因目前仍无法阐明，根据免疫学有关理论，机体对自身成份失去免疫耐受性是一个重要的环节，而这种自身抗原一般为机体的正常成份，疾病的发生可能系淋巴细胞的“禁忌株”失禁忌，从而导致异常自身免疫效应的B和/或T淋巴细胞克隆的出现。因此设法清第四军医大学硕士学位论文除识别相关抗原的B和／或T淋巴细胞克隆，有可能达到治疗相关自身免疫性疾病的目标。本课题组目前正在进行白斑风相关抗体识别人源性黑素细胞抗原的。DNA克隆及表位确定等方面的研究，拟将克隆纯化的表位肽段做成亲合层析柱吸附患者体内的相关自身抗体，再将偶联毒素的表位肽段注入体内清除识别该抗原的淋巴细胞克隆，从理论上可清除失禁忌的病理性淋巴细胞株，从而达到治疗白匣风。目的检测和分析白痰风相关的黑素细胞膜抗原，初步纯化目的抗原，作抗原的活性测定，为筛选、克隆黑素细胞膜抗原及膜抗原蛋白质测序打下基础。方法培养大量健康人黑素细胞（MC），裂解第六代黑素细胞，得到可溶性黑素细胞抗原。同时活细胞ELISA法筛选高滴度白掇风患者IgG 血清。而后用黑素细胞抗原和高滴度 IgG血清作蛋白印迹（Western Blot＊检测与白掇风自身抗体相结合的自身抗原是否存在，并分析其分子量及筛选相对应的IgG血清，为进一步抗原的纯化奠定基础。biotinj利Hs生物素标记黑素细胞裂解产物，50mMNH4CI终止反应，Protein A－Sepharose 预清除标记的黑素细胞抗原，加入筛选血清与 Protein A七epharose进行免疫共沉淀，沉淀后的抗原抗体复合物煮沸后行SDS－PAGE电泳，免疫沉淀复合物电印迹，在 NC膜上加 20mu加l的碱性磷酸酶标记的亲合素，最后用化学发光法检测及鉴定。结果238份白瘦风血清中，共获1：200的高滴度阳性血清98例，选取用于本研究的30份血清中，寻常型白瘦风27例，其中活动期26例、稳定期二例。节段型白癫风3例，均处于活动期。用高滴度抗正常人黑素细胞膜抗原的白披风血清做免疫印迹检测分析，30例患者均有数个阳性条带，正常人血清对照组仅 1例（10％）出现阳性条带，白瘦风患者明显－3· 第四军医大学硕士学位论文高于对照组什习1．00，AO．of人白癣风血清中抗正常人黑素细胞抗体主要针对的抗原分子量为 150KD、90 I｛D、75 KI）、50 KI）、40个5 I（l，其中阳性率最高的抗原分子量为 75 p抢3们，其次为 150KDO0们、90 I｛D u 人 40叶5 KDQ3肋、50 KD门人另外结果分析发现阳性条带的分子量大小及单个条带出现频率与白癫风分型、活动性及皮损面积无相关性。以 oestern Blot检测结果中筛选 10例高滴度血清。均为寻常型、活动期的白瘦风患者，选取的血清在免疫印迹检测中90KD和75KD的抗原条带都为阳性，正常人对照血清4份。免疫沉淀、免疫印迹、化学发光法检测后发现10例患者均有阳性条带。血清抗体主要针对的抗原分子量为 150KD、90 I｛D、75 KD、60 KD，阳性条带最多的抗原分子量为 90 KD（6 例）和 75KD（6例），其次为 150 KD（4例）、60KD（4例）和 200KD（2 例）。结论白掇风患者血清中存在抗黑素细胞抗体，进一步支持了自身免疫学说。抗原的分子量约为150KD、90 KD、75 KD、50 KD、40－45 n。而膜抗原分子量主要为 150KD、90 KD、75 KD，以往发现的一些小分子抗原可能为大分子抗原的降解产物，通过免疫共沉淀初步纯化了150KD、90 KD和75KD的抗原。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R758.41

【参考文献】