掌跖脓疱病发病机制研究

发布时间：2020-05-14 04:15

【摘要】：背景和目的根据发病部位不同,脓疱性银屑病基本上可分为两型:泛发性脓疱性银屑病和掌跖脓疱病。泛发性脓疱性银屑病(generalized pustular psoriasis GPP)患者全身出现脓疱,可伴发热,部分患者发病可能与IL36RN基因突变触发异常炎症反应通路有关。IL36RN 基因(Interleukin-36 receptor antagonist gene)编码 IL-36Ra 蛋白(Interleukin-36 receptor antagonist),IL-36Ra 是 IL-36 包括 IL-36y 的天然拮抗剂,IL-36Ra通过与IL-36R(IL-36 receptor)结合从而阻断IL-36介导的炎症反应。IL36RN基因突变则导致IL-36Ra结构功能异常,失去拮抗IL-36y能力,此时IL-36y可通过激活细胞信号传导通路使IL-8异常表达。IL-8是中性粒细胞活化及趋化因子,可募集中性粒细胞在表皮聚集形成脓疱。研究表明GPP患者血清中IL-8、IL-36y浓度较正常对照者明显升高,皮损IL-8、IL-36γ较正常对照、扁平苔藓等其他炎症性皮肤病皮损明显升高,而IL-36Ra表达水平明显下降。掌跖脓疱病(palmoplantar pustulosis PPP)是一种主要局限于手掌、足跖的慢性复发性炎症性皮肤病,皮损以红斑、鳞屑及脓疱为特点,有学说认为它是GPP的局限型。PPP流行病学资料有限,报道日本患病率为0.12%,好发于45-65岁女性。PPP发病机制复杂,现报道其发病与遗传、免疫、汗腺汗管、IV型变态反应、感染、甲状腺疾病等相关。PPP患者皮损汗液分泌量较非皮损部位及健康对照者降低,汗管周围存在组织细胞、T细胞等炎症细胞浸润。然而,PPP发病机制相关研究较缺乏。IL-8、IL-36γ、IL-36Ra在PPP发病机制中的作用尚无相关研究,中国PPP患者IL36RN基因突变情况也未见报道。因此,我们拟探索掌跖脓疱病患者皮损中IL-8,IL-36y,IL-36Ra与汗管在PPP发病中的所起的作用,以及中国PPP患者是否与泛发性脓疱性银屑病一样,存在IL36RN基因突变。研究对象收集2014年5月至2016年12月就诊于北京协和医院皮肤科门诊经临床或病理确诊的51例PPP患者外周血标本及临床资料,外周血标本用于提取DNA,并通过PCR技术扩增IL36RN基因外显子及其侧翼序列。选取其中17例PPP患者皮损组织用于免疫组织化学染色,并以14例寻常型银屑病(psoriasis vulgaris PSV)患者皮损组织及12例正常皮肤作对照。此外,选取其中7例PPP患者皮损组织进行逆转录荧光定量PCR(RT-PCR),以8例PSV皮损组织及6例正常皮损组织作对照。留取皮损组织时,PPP及PSV患者均处于疾病活动期,就诊前6周未进行系统或局部治疗。正常皮肤组织来自手术切除的掌跖色素痣边缘正常皮肤。方法1.RT-PCR检测患者皮损中IL-8、IL-36γ及IL-36Ra mRNA表达量:Trizol法提取新鲜皮肤组织总RNA。应用试剂盒(GoscriptrM Reverse Transcription system)将RNA 逆转录为 cDNA。使用 FastStart Universal SYBR Green 及 ABI 7500 Real-Time PCR进行RT-PCR。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。通过RT-PCR的扩增及溶解曲线判断扩增效率,根据目的基因和内参比值以2-△△Ct分别计算IL-8、IL-36γ及IL-36RamRNA的相对表达量。2.IL-8、IL-36γ、IL-36Ra及EMA免疫组织化学染色:石蜡包埋组织,4μm厚连续切片,免疫组织化学染色采用Envidion二步法,DAB显色,不加一抗作阴性对照。免疫组化结果分析:由两位医师采用双盲法进行组织阳性部位及染色强度进行判读。表皮IL-8、IL-36γ及IL-36Ra染色强度采用半定量方法评估:0=不着色,1=弱着色,2=中等着色,3=强着色。3.IL-36γ干预HaCaT细胞:体外培养人永生化角质形成细胞HaCaT细胞株,应用浓度分别为80、100及120ng/mlIL-36γ刺激细胞,并设置空白对照组。六孔板培养细胞,48h后收集HaCaT细胞提取总RNA,通过RT-PCR测定细胞中IL-8 mRNA的表达量;同时收集细胞上清,采用Elisa方法检测上清液中IL-8表达水平。4.应用试剂盒(AxyPrepBloodGenomic DNAMiniprepkit)提取 51 名 PPP 患者外周血基因组DNA,通过GenBank(NM_012275)获取IL36RN基因序列,使用Primer 5设计7对引物。以患者DNA为模板,采用多聚酶链方法(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增IL36RN基因及其侧翼序列,并进行Sanger测序。分析患者DNA序列,使用SIFT/PolyPhen软件预测突变蛋白的功能。结果1.IL-8mRNA在PPP皮损中的表达水平较PSV及健康对照者均明显升高(P值均＜0.01);IL-36γmRNA在PPP皮损中的表达水平较正常对照及PSV均升高,与正常对照比较具有统计学意义(p=0.01),与PSV比较无统计学差异(p=0.85)。IL-36Ra mRNA在PPP及PSV皮损中的表达水平较正常对照均明显升高(P＜ 0.001P＜0.01),在PPP及PSV中的表达水平无明显差异(p=0.286)。2.IL-8蛋白在PPP皮损中的表达水平较PSV及健康对照者均明显升高,具有统计学差异(P＜0.01P=0.04);IL-36γ蛋白在PPP皮损中的表达水平较正常皮损明显升高(P=0.01),与PSV皮损比较无明显差异(P=0.65);IL-36Ra蛋白表达水平在PPP,PSV及健康对照皮损中均无明显差异(P均0.10)。3.PPP皮损脓疱中中性粒细胞IL-8染色强阳性;PSV皮损中除Muro微脓疡外,IL-8染色阴性;PPP皮损脓疱疱壁细胞及周围角质形成细胞IL-36γ、EMA染色阳性,两者染色阳性位置重叠。此外,真皮汗管细胞胞质IL-36-γ染色阳性。IL-36Ra在PPP、PSV及正常对照皮肤角质形成细胞胞质阳性表达。4.不同浓度(80ng/ml,100ng/ml,120ng/ml)IL-36y干预HaCaT细胞后,细胞IL-8 mRNA转录水平及细胞上清液中IL-8分泌水平较空白对照组均升高,当IL-36y培养浓度为1OOng/ml时升高最明显,与对照组比较有统计学差异(P=0.03P=0.01)。5.51例PPP患者中,9例患者发生单碱基错义置换突变,共4种基因突变类型。其中5例患者发生c.140AG/p.Asn47Ser,2例发生c.258GA/p.Met86IIe,1 例发生c.115+6TC及1例c.169GA/p.Va157IIe突变,所有患者均为杂合突变。与人类基因组数据库及己报道致病突变基因比对,这些突变位点在PPP患者中可能不存在致病性。且有突变及无突变PPP患者的疾病严重程度、发病年龄及病程均无明显差异(P值均0.1)。结论1.PPP皮损中IL-8、IL-36γmRNA及蛋白表达水平均异常升高,IL-36Ra表达水平正常。IL-8、IL-36γ在PPP发病中起重要作用,IL-36Ra可能不是PPP的发病相关因素。2.PPP皮损脓疱可能于表皮顶端汗管处形成,并与IL-36γ、IL-8异常表达相关。汗管细胞可表达IL-36γ。3、IL-36γ可直接刺激人永生化角质形成细胞异常表达IL-8。4、51例中国PPP患者中未发现IL36RN基因明确致病突变,其发病与IL36RN基因突变可能不相关。
【图文】：

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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R758.6

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