关于富血小板血浆对毛发生长周期影响的机制探究

发布时间：2020-05-15 03:50

【摘要】：背景:脱发是一个世界性难题,其最主要的类型为雄激素源性脱发(Androgenetic alopecia,AGA)。我国有流行病学调查表明,AGA患者中有家族遗传史的占比53.3%～63.9%,父系明显高于母系。关于AGA患者目前的治疗,主要为毛发移植手术治疗和药物治疗。而对于毛发移植手术治疗,一些大面积脱发患者,毛发移植手术因难以提供足量的供区毛囊而导致应用受限;而对于药物治疗,如非那雄胺等,也因自身存在一定的副作用而被部分患者排斥。所以,临床上迫切需要一种安全有效且广泛适用的方案来治疗雄激素源性脱发。富血小板血浆(Platelet-rich Plasma,PRP)是目前临床较为关注的一种新型治疗AGA的方法,PRP是自体血小板和血浆浓缩物,已有初步的动物实验和临床研究证据表明,PRP可促进脱发区处于衰退期的毛囊重新进入新的毛囊周期,并可延长毛发生长期并延缓其向退行期的转换,其作为一种治疗脱发的新型疗法,展现了独特的优势。本课题组前期也进行约50例AGA患者的脱发区行PRP微针注射治疗,约80%以上的患者脱发有明显改善,且毛发质量及数量也有所改善。但PRP对毛发生长周期的促进作用的相关机制暂不明确,既往研究也涉及较少,因此,本实验构建PRP对毛发影响的动物模型,将获得的PRP注射至小鼠背部皮下,后进行相关检测,以探究PRP对毛发生长周期的作用机制。目的:(1)验证PRP有促进毛发生长的作用;(2)探究PRP对毛发生长周期的作用机制;(3)为临床应用PRP微针注射促进脱发患者毛发再生提供理论依据。方法:(1)制备温控富血小板血浆(t-PRP)采取健康成人静脉血100ml,放入冰盒,在4℃离心机内经两步差速离心法制备PRP/PPP,因本课题组所制备的PRP的过程始终处于低温环境下,故将其称之为温控富血小板血浆,即t-PRP。(2)t-PRP微针注射C57BL/6小鼠背部皮下取5～6周龄的C57BL/6小鼠20只,随机分为实验组(t-PRP组)的对照组(PPP组),每组各10只,先将其背部毛发用脱毛膏脱毛,从背部正中线将其划分为左右两部分,左侧背部皮下注射t-PRP/PPP,右侧注射同等剂量的生理盐水,分别每隔3天注射一次,共注射3次。(3)观察t-PRP/PPP注射后对小鼠毛发周期的影响并进行相关检测分别取不同时间段的实验组(t-PRP)和对照组(PPP)C57BL/6小鼠,观察注射部位的毛发情况的大体观,并进行相关检测:如将小鼠背部皮肤取材后,石蜡包埋后切片行组织切片HE染色,并行蛋白芯片检测,根据蛋白芯片检测后的结果,再行qRT-PCR、Western-blot对实验结果进行进一步验证。结果:(1)分别对t-PRP/PPP/生理盐水注射后不同时期(1、2、5、7周)的小鼠背毛进行大体观察,发现注射t-PRP的小鼠背毛第2、5、7周较PPP组和生理盐水组背部皮肤颜色较深,且毛发较其他组更长,而PPP组和生理盐水组则无明显差异。(2)分别取材t-PRP/PPP/生理盐水注射后不同时期(1、2、5、7周)的小鼠背部皮肤,行HE染色后发现t-PRP组小鼠背部毛发较其他组更早进入生长期;行蛋白芯片检测显示:小鼠t-PRP注射组背部皮肤较对照组中的PDGF、Ki67、β-catenin蛋白量明显高于阴性对照组(PPP注射组)及生理盐水组。(3)根据蛋白芯片的检测结果,对毛囊周期相关蛋白进行RNA水平检测,如分别对t-PRP/PPP/生理盐水注射后不同时期(1、2、5、7周)的小鼠背部皮肤进行取材,行qRT-PCR、Western-blot对实验结果进行进一步验证,发现与上述阳性结果一致。
【图文】：

富血小板血浆,控制条件,常规方法,血小板

逡逑心率为１５５０ｇ，ｌＯｍｉｎ，离心后血小板在离心管底层形成软凝块（图１－ｌｂ），提逡逑取上层约２／３的血浆为贫血小板血浆（ＰＰＰ），后将血小板凝块在剩余血浆中匀浆逡逑后得到温控富血小板血浆（ｔ－ＰＲＰ）（图１－ｌｃ），平均每１０ｍｌ静脉血可制备逡逑ｌｍｌ邋ｔ－ＰＲＰ。至此得到的ｔ－ＰＲＰ中血小板浓度为为原全血中血小板浓度的６？８倍。逡逑９邋ｂ逦ｃ逦：：逡逑图ｌ＿＿ｌｔ－ＰＲＰ的制备ａ：第１次离心后，上层为血小板和血浆浓缩物，下层为红细胞层；ｂ：逡逑第２次离心后，上层为贫血小板血浆（ＩＭＴ），底层为血小板软凝块；ｃ：匀浆后的温控富逡逑血小板血浆（ｔ邋ＰＲＰ）。逡逑Ｆｉｇ．邋１－ｌＴｈｃ邋ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰＲＰ．邋Ａ．Ａｆｔｅｒ邋ｔｈｅ邋ｆｉｒｓｔ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，邋ｐｌａｔｅｌｅｔｓ邋ａｎｄ邋ｐｌａｓｍａ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ逡逑ｗｅｒｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｕｐｐｅｒ邋ｌａｙｅｒ邋ａｎｄ邋ｅｔｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ邋ｉｎ邋ｌｌｉｅ邋ｌｏｗｅｒ邋ｌａｙｅｒ．Ｂ．Ａｆｔｅｒ邋ｔｈｅ邋ｓｅｃｏｎｄ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ

休止期,毛发,生理盐水,退行期

鼠毛囊则进入该生长周期的生长期。注射后第７周，ｔ－ＰＲＰ注射组小鼠左侧背部逡逑皮肤呈现灰黑色，而右侧背部皮肤和ＰＰＰ注射组背部皮肤左右两侧皮肤皆为灰逡逑白至浅粉色（图１－２邋ｅ）；表明ｔ－ＰＲＰ注射组小鼠毛囊己经进入新一轮生长周期逡逑的生长期，而ＰＰＰ／生理盐水组则仍位于上一毛发周期的退行期至休止期。以上逡逑观察说明，ｔ－ＰＲＰ促进小鼠毛发从休止期进入生长期，并可维持生长期，延迟其逡逑从生长期进入退行期，而ＰＰＰ和生理盐水注射组毛发周期始终保持一致，，说明逡逑ＰＲＰ中促进毛发生长及周期改变的是浓缩的血小板，而不是血浆。逡逑0ｗ逦１邋ｗ逦２＼ｖ逦５ｖｖ逦７ｗ逡逑ＩＨ￡ＩＥ逡逑图１邋２邋ｔ邋ＰＲＰ注射后不同时间段大体观ａ：邋ｔ邋ＰＲＰ邋（左）／生理盐水（右）注射；ｂ：注射后逡逑第１周：ｃ：注射后第２周，左侧毛发处于生长期，右侧处于休止期；山注射后第５周，逡逑左侧毛发处于休止期，右侧处于生长期；Ｅ：注射后第７周，左侧毛发处于生长期，右侧处逡逑于退行期。逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋ａ：邋ｔ－ＰＲＰ邋（ｌｅｆｔ）／ｎｏｎｎａｌ邋ｓａｌｉｎｅ邋（ｒｉｇｈｔ）邋ｉｎｊｃｃｔｉｏｎ；ｂ：Ａｔｌｈｃ邋１ｓｔ邋ｗｅｅｋ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；ｃ：Ａｌ邋ｔｈｅ邋２ｎｄ逡逑ｗｅｅｋ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，邋ｔｈｅ邋ｈａｉｒ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ邋ｓｉｄｅ邋ｗａｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｐｈａｓｅ
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R758.71

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