基于转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术探讨天疱疮发病机制的研究

发布时间：2020-05-18 11:37

【摘要】：研究背景天疱疮(pemphigus)是一种罕见的,会危及患者生命的自身免疫性疾病,以出现针对角质层形成细胞表面桥粒成分的特异性抗体引起棘层细胞松解为特征。天疱疮可分为寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris,PV)、落叶型天疱疮(pemphigus foliaceous,PF)、红斑型天疱疮(pemphigus erythematosus,PE)和副肿瘤型天疱疮(paraneoplastic pemphigus,PNP)等。其中PV是天疱疮中最常见的类型,其次是PE和PF。PE复发频繁,但是在疾病缓解、持续时间和医源性并发症方面却与PV类似,二者的病情演化也有相似之处。天疱疮的发病机制十分复杂,目前仍未明确,遗传和环境因素都会对天疱疮的发病造成影响。近年来,随着“后基因组”时代的到来,以大规模测序为基础的多种组学技术相继出现,这其中应用最为广泛的包括转录组学、蛋白质组学及代谢组学等,并且已经成为许多医学工作者进行科学研究的重要工具。课题组前期的研究中,曾采用多种组学技术(转录组学、蛋白质组学和代谢组学)分析探讨系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的发病机制,发现SLE患者中多个表达异常的基因m RNAs、蛋白质和代谢物,这些差异分子在多种生物学过程中起作用,并参与了多条关键信号转导通路。通过转录组学分析,可以获得基因表达的RNA水平的相关信息,可以探索基因表达与机体生理、病理等状态下的生命现象之间的内在联系。通过蛋白组学分析,可以从整体角度分析细胞和组织内部不断动态变化的蛋白质组成成分及表达水平等,了解蛋白质之间的相互作用,旨在阐明全部蛋白质的表达及功能模式。而代谢组学是转录组学和蛋白质组学的下游,代谢组分的变化是机体对遗传、环境或是疾病影响的最终应答反应。生物学反应往往不是单一因素引起的,而是基因、m RNAs、蛋白质和代谢物等多种因素共同作用的结果。因此,整合不同平台的组学数据成为必要的工作。转录组与蛋白组表达数据的关联研究是一种思路,它们之间的联合分析能揭示基因表达的转录后调控状态,实现二者之间的互补和整合,所以从转录组和蛋白组的联合分析已成为医学研究发展的必然趋势。天疱疮患者体内生物学反应复杂,是多种因素共同作用的结果,从某一组学角度进行分析具有一定的局限性,且天疱疮由于其患病率低,病例收集困难,当前鲜有相关的组学研究,尤其目前尚无天疱疮的多组学联合分析研究。因此,本研究拟采用转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术进行综合研究,检测天疱疮患者和健康人群中的差异m RNAs、蛋白质和代谢物,并对这些分子进行生物信息学功能分析。然后,联合转录组学和蛋白质组学表达数据进行分析,并对共同表达差异因子进行验证,根据这些因子寻找天疱疮发病机制中的关键信号转导通路,希望可以为阐明天疱疮的发病机制和选择治疗靶点的提供科学依据。研究一天疱疮患者的转录组学、蛋白质组学和代谢组学研究目的检测天疱疮患者中表达异常的基因mRNAs、蛋白质和代谢物,探讨它们参与的生物学反应过程和相关信号通路。方法共收集到17例天疱疮患者,包括12例PV患者、5例PE患者,按性别、年龄匹配正常对照组,采集天疱疮患者和正常对照组研究对象的血液样本;转录组学实验使用RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术进行;蛋白质组学实验使用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)技术进行;代谢组学实验使用高效液相色谱串联质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技术进行。转录组和蛋白组实验需要将样本混合,每2~3例血液样本混成1例样本,由此产生PE:2例样本;PV:4例样本;正常对照:6例样本。转录组学实验中,筛选差异基因标准为差异倍数≥2.00和FDR≤0.001;蛋白质组学实验中,筛选差异蛋白的标准为差异倍数≥1.200或≤0.833(所有比较组比值的平均值)和P-value0.05(所有比较组的t-test)。代谢组学实验中,筛选标准为PLS-DA中变量投影重要性(variable importance in the projection,VIP)≥1并且火山图中差异倍数≥1.200或者≤0.833且Q值0.05。GO富集分析探索表达差异的RNAs和蛋白质参与的生物学反应和表现的分子功能,KEGG分析探索表达差异的RNAs、蛋白质和代谢物富集的信号转导通路。结果(1)转录组学实验结果表明,与健康人群相比,PV患者中有871个差异表达基因m RNAs,其中43个上调,828个下调;PE患者中有478个基因差异表达基因m RNAs,其中34个上调,444个下调。GO富集分析显示:PV:差异基因m RNAs主要是参与钾离子转运和甲基转移等功能;PE:差异基因m RNAs主要富集在胞质核糖体、胞质大核糖体亚基和核帽结合蛋白质复合物三个部分,主要表现钾离子转运体活动和钾:质子转运体活动等功能,主要参与了核转录信使RNA分解过程、SRP:依赖于蛋白质的平动蛋白及共平蛋白靶向膜等6个过程。KEGG富集分析显示:PV:差异基因m RNAs主要参与RNA降解、肿瘤中的异常调节及核糖体等通路中;PE:差异基因m RNAs主要参与RNA降解、核糖体、m RNA监控及胞质DNA-传导通路等通路中。与健康人群相比,在PV患者中,我们共检测到1 924个差异表达的lnc RNAs,包括65个上调的lnc RNAs和1 859个下调的lnc RNAs。PE患者中,我们共检测到1 753个差异表达的lnc RNAs,包括84个上调的lnc RNAs和1 669个下调的lnc RNAs。GO分析显示PV患者中差异lnc RNAs的靶基因的分子功能表现为核酸跨膜转运活性和RNA跨膜转运活性;PE患者中差异lnc RNAs的靶基因的分子功能主要表现为结合珠蛋白结合。KEGG分析显示PV患者中差异lnc RNAs的靶基因主要富集RNA降解、剪接体及赖氨酸降解等通路中;PE患者中lnc RNAs的靶基因主要富集RNA降解、剪接体及基底细胞癌等通路中。(2)蛋白质组学实验结果显示:与健康人群相比,PV患者中共鉴定到341个表达差异的蛋白质,其中288个蛋白质显著上调,53个蛋白质显著下调;PE患者中共鉴定到198个表达差异的蛋白质,其中122个蛋白质显著上调,76个蛋白质显著下调。GO富集分析显示:PV:所参与的生物学过程包括细胞酮代谢过程调节、对有丝分裂细胞周期的g1/s转移的负调控、和T细胞受体信号通路等,其中分泌细胞因子和T细胞受体信号通路是与免疫相关的生物学过程;PE:差异蛋白质表现出的分子功能包括丝氨酸蛋白酶活动、丝氨酸水解酶活动、丝氨酸肽链内切酶活动等;所参与的生物学过程为参与的生物学过程为RNA转录酶II启动子的转录、调节肽分泌及淋巴细胞迁移的负调控等。其中淋巴细胞迁移的负调控是与免疫相关的生物学过程;KEGG富集分析显示:PV:差异蛋白质主要参与蛋白酶体、过氧化物酶体、戊糖、葡萄糖醛酸转换及胶质瘤通路等通路;PE:差异蛋白质主要参与凝血和补体通路、丙酮酸代谢、RAS信号通路及基底转录因子通路等通路。(3)代谢组实验结果表明,与健康人群相比,PV:正离子模式下:鉴定到88个差异离子,其中55个离子上调,33个离子下调;负离子模式下:鉴定到144个差异离子,其中103个离子上调,41个离子下调;PE:正离子模式下:鉴定到2个差异离子,其中1个上调,1个下调;负离子模式下:鉴定到5个差异离子,全部上调。KEGG分析显示:PV患者:正离子模式下共鉴定到27条代谢通路,包括代谢途径、鞘酯类代谢及甘油磷脂代谢)等通路,负离子模式下共鉴定到29条代谢通路,包括代谢途径、鞘酯类代谢及胆汁分泌等;PE患者:正离子模式下共鉴定到2条代谢通路,即代谢途径及初级胆汁酸生物合成;负离子模式下未鉴定到差异基因明显富集的代谢通路。结论天疱疮患者中多个基因m RNAs、蛋白质和代谢物表达异常,这些差异分子表现了多种生物学功能、参与了多种生物学反应和信号转导通路。研究二基于转录组和蛋白质组关联研究技术探讨天疱疮发病机制的研究目的联合应用转录组学与蛋白质组学寻找天疱疮患者在基因及蛋白水平上共同差异表达的分子,通过生物信息学方法了解其生物学特性及功能,通过检测差异蛋白质的血浆浓度进行验证,探讨它们与天疱疮之间的相关性,希望可以为探讨天疱疮的发病机制提供依据。方法将在蛋白水平和转录水平关联到的所有表达数据进行Pearson相关分析。基于mRNA水平和蛋白质水平的表达结果,划分为不同的关联类型,分别分析;根据关联分析结果找出共同表达差异(即同时上调或下调)的分子(蛋白质),使用ELISA方法验证共同表达差异的的蛋白质,进入最终验证阶段的样本量为21例PV患者、6例PE患者及27例正常对照;对关联上的蛋白质进行GO和pathway注释分析。对于PV、PE患者和正常对照组人群血浆蛋白的浓度,用K-S检验验证其是否符合正态分布。对于符合正态分布的变量,以均数±标准差((?)±S)表示;对于不符合正态分布的变量,用中位数(四分位数间距)表示。候选血浆蛋白浓度在不同实验组表达情况采用两独立样本t检验或两独立样本非参数检验。使用SPSS 23.00软件进行统计分析,检验水准α=0.05。结果(1)对显著差异蛋白质和显著差异基因进行关联分析,并计算其相关性系数,PE:相关系数为-0.1091;PV:相关系数为:0.1079;(2)根据关联分析结果找出共同表达差异(即同时上调或下调)的分子(蛋白质),PV:共有8个分子表达趋势相同,相关系数:0.6108,共有8个分子表达趋势相同(共同上调或下调),包括中性粒细胞防御素Ⅰ(DEF1);血红蛋白β(HBB);转胶蛋白2(TAGLN2);血红蛋白α(HBA);炭疽毒素受体2(ANTXR2);CD14;β-微管蛋白5(TBB5);桥粒联结蛋白2(AHNK2);PE:共有5个分子表达趋势相同,相关系数:0.4000,共有5个分子表达趋势相同(共同上调或下调),包括:核糖体结合因子(RBFA);妊娠区带蛋白(PZP);血浆铜蓝蛋白(CERU);人S100钙结合蛋白A9(S100A9);肝素辅因子Ⅱ(HEP2);(3)对共同表达差异(即同时上调或下调)的13个分子(蛋白质)进行ELISA验证,PV组:CD14、TBB5、DEF1、TAGLN2和ANTXR2的表达水平与关联分析的结果一致。正常对照组中的CD14和ANTXR2的表达水平分别为64.26(60.10,70.90)μg/ml和476.03(429.22,913.37)pg/ml,高于PV组的58.49(55.17,64.57)μg/ml和407.05(340.06,609.70)pg/ml,两组间差异均有统计学意义(均有P0.05)。PV组DEF1、TAGLN2和TBB5的表达水平分别为128.40(100.13,237.79)ng/L、1335.25(1109.65,1580.89)pg/ml和4624.04(3422.90,6081.51)pg/ml,均高于对照组,差异均有统计学意义(均有P0.05)。其他因子间差异均无统计学意义。PE患者中CERU和S100A9的表达水平与关联测序结果一致,PE患者的各蛋白的表达水平与对照组间差异均无统计学意义(均有P0.05);(4)PV:关联上的变化趋势相同的蛋白质分别参与了11种细胞组成以及19个生物学过程,共有7种分子功能;PE:关联上的变化趋势相同的蛋白质分别参与了8种细胞组成以及14个生物学过程,共有4种分子功能;PV:关联上的变化趋势相同的蛋白质共参与了17条通路,NOD样受体信号通路、NF-κβ信号通路、Toll样受体通路和造血细胞系通路是与免疫系统相关的通路;PE:关联上的变化趋势相同的蛋白质共参与了3条通路,其中补体和凝血通路以及IL-17信号通路是与免疫系统相关的通路。结论PV组关联上的蛋白质共有8个(DEF1、HBB、TAGLN2、HBA、ANTXR2、CD14、TBB5、AHNK2),PE组关联上的蛋白质共有5个(RBFA、PZP、CERU、S100A9、HEP2)。ELISA实验检测发现PV组CD14、TBB5、DEF1、ANTXR2和TAGLN2的表达水平与关联分析的结果一致,关联上的因子可能通过影响了与免疫相关的NF-kβ信号通路、Toll样受体通路和造血细胞系通路,参与了天疱疮的发生、发展的过程。联合应用新技术、新方法可为天疱疮的诊断及治疗提供一个新的方向。
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实验流程

图 1 mRNA 实验流程Fig 1 Experiment process of mRNA2.3.1.4.4 LncRNA 检测（1）使用生物素标记的特异性探针（Ribo-Zero rRNA Removal Kit）将提取出的总 RNA去除核糖体 rRNA；（2）纯化后，将 RNA在一定的温度和离子环境下片段化；（3）随后使用 TruSeq Stranded kit 中随机引物和反转录酶合成 cDNA 一链，然后使用 DNA 聚合酶 I和 RNAseH 来合成双链的 cDNA；（4）在 cDNA 双链合成过程中，RNA 模板被去除，dTTP 被 dUTP 所替换。dUTP 的参与使 cDNA 的二链无法在后续流程中被扩增，因为聚合酶在延伸时无法跨过模板上的 dUTP 位点。双链的 cDNA 产物随后进行了加“A”碱基和接头连接。连接产物将被扩增，纯化后即得到了最终的 cDNA 文库。最后将构建好的测

实验流程

28图 2 LncRNA 实验流程Fig 2 Experiment process of LncRNA2.3.1.4.3.5 信息分析流程测序所得数据称为 raw reads。将低质量、未知碱基 N 含量过高及接头污染的reads 过滤，过滤后的数据称为 clean reads；将 clean reads 与参考基因组进行比对；组装转录本；进行编码能力预测（组转后的新转录本），区分新的 mRNAs 和lncRNAs。这些新的将与已知的 lncRNA和 mRNA一起进行后续的分析。定量所有的 RNAs（包括 lncRNsA 和 mRNAs），与正常对照进行比较，进行差异分析和富集分析等。1. 数据过滤受样品质量的影响，实验方法去核糖体的效率可能不太稳定，而核糖体的污
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R758.66

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