淋病奈瑟菌粘附因子受体hCEACAM1转基因小鼠模型的建立及初步应用

发布时间：2020-05-24 06:33

【摘要】： 淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)是导致人类淋病(gonorrhea)的病原菌。人是淋病奈瑟菌的唯一宿主,经性行为传播,多侵袭泌尿生殖道黏膜,主要引起男性的急性尿道炎、前列腺炎、附睾炎等;在女性主要以隐形感染为主,常因不能及时医治而最终导致盆腔炎、子宫内膜炎、输卵管炎、甚至导致不孕症。淋病在全球范围内流行广泛,是发病率最高的性传播疾病(STD)之一。近年来随着淋病奈瑟菌耐药性的日益增强,淋病的治疗变得越发困难,深入研究淋病奈瑟菌的生物学特性及其与宿主间的相互作用机制,研制有效的淋病疫苗和治疗药物成为淋病防治工作的重中之重。但是缺乏有效的动物模型却阻碍着淋病的研究进程。研究证实,黏附定植于黏膜组织是淋病奈瑟菌感染的第一步,也是关键性的一步。淋病奈瑟菌的黏附定植是一个非常复杂的过程,涉及淋病奈瑟菌多种黏附因子和机体细胞上相应受体间的相互作用,其中Opa蛋白与其受体间的结合使得淋病奈瑟菌最终得以实现感染。Opa蛋白是淋病奈瑟菌编码的一组易变异的外膜蛋白,共有11～12种:OpaA、B、C……K(L)。绝大多数种类的Opa蛋白可以人癌胚抗原相关细胞黏附分子1 (human carcinoembryonic antigen related cellular adhesion molecule 1, hCEACAM1)为受体,95%以上的淋病奈瑟菌临床分离株均可与hCEACAM1结合。Opa蛋白与hCEACAM1的结合使得淋病奈瑟菌的黏附作用更加紧密,淋病奈瑟菌进而穿过上皮细胞,进入黏膜下层产生炎症。直接表达于泌尿生殖道黏膜上皮细胞顶面的hCEACAM1提供了淋病奈瑟菌感染的穿入点或侵入组织的一扇门,在淋病奈瑟菌的感染过程中具有重要意义。细胞模型研究证明,表达hCEACAM1的动物细胞均可以接受淋病奈瑟菌的粘附和侵入,提示hCEACAM1转基因小鼠可成为淋病研究的良好动物模型。本课题利用前期构建的hCEACAM1真核表达载体,通过显微注射法制备了hCEACAM1转基因小鼠,并初步研究了其在淋病奈瑟菌感染动物模型中的应用价值。研究主要分为以下几个部分: 一、显微注射法制备hCEACAM1转基因小鼠在本实验室前期工作的基础上,将表达hCEACAM1的基因构件通过显微注射的方法注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵中,得到hCEACAM1转基因F0代小鼠共22只。通过PCR技术反复筛选并将PCR产物测序分析,得到4只(50#、53#、54#、59#)PCR阳性的hCEACAM1 F0代转基因小鼠。初筛后的4只PCR阳性小鼠分别与同品系正常小鼠交配繁殖,得到的F1代小鼠通过PCR方法反复筛选,对阳性小鼠进行同组间的兄妹交配,得到F2、F3代转基因小鼠。F2、F3代转基因小鼠同样通过PCR的方法进行反复筛选,得到的阳性小鼠继续采用同组的兄妹交配方法进行繁殖,以期能得到纯合子的hCEACAM1转基因小鼠。二、hCEACAM1多克隆抗体的制备为了进一步分析hCEACAM1蛋白在转基因小鼠体内的表达情况,通过分析,找出hCEACAM1蛋白胞外区中抗原特异性最强的一段表位,采用PCR方法扩增出其编码序列,并将其连进pGEX-4T-1载体中,进行原核表达。以表达的GST-hCEACAM1融合蛋白为抗原,应用切胶免疫的方法制备了抗hCEACAM1的多抗血清。通过与商品化的hCEACAM1单抗比较,证实了所制备的抗hCEACAM1多抗血清能特异性识别hCEACAM1蛋白。三、hCEACAM1转基因小鼠体内目的基因的表达应用制备的hCEACAM1多抗血清对4只F0代PCR阳性转基因小鼠进行了体内hCEACAM1蛋白表达情况的分析。通过Western-blot方法证实,在4只F0代PCR阳性小鼠中,只有53#F0代小鼠及其后代体内各组织器官表达了hCEACAM1蛋白,同时应用免疫荧光的方法证实了hCEACAM1蛋白定位表达于细胞膜上。由此鉴定,我们成功获得了hCEACAM1转基因小鼠。四、hCEACAM1转基因小鼠的淋病奈瑟菌感染实验为研究hCEACAM1转基因小鼠在淋病研究中的应用价值,我们在转基因小鼠数量较少的情况下,选择了4只hCEACAM1阳性小鼠,进行了淋病奈瑟菌体内感染实验。实验结果表明,相对于对照组的正常小鼠,淋病奈瑟菌在hCEACAM1转基因小鼠中的存活时间显著延长,但是没有引起小鼠产生炎症反应。由于实验小鼠的数量严重不足,这只是对淋病奈瑟菌体内感染实验的一个初步探索,不具有统计学意义,但其结果预示着其作为研究淋病动物模型的可能性。
【图文】：

基因结构,外显子

不同的 mRNA 剪接模式，但是具有相似的组织特异性表达模式。①小鼠 CEACAM1 基因编码 9 个外显子(见图 1A) 。外显子 1 为起始密码子ATG，外显子 2-5 (D1-D4)编码 Ig 样结构域，外显子 6 编码跨膜区(TM)，通过选择性拼接去除含有 53 个碱基对的外显 7，把 CEACAM1 分为 CEACAM 1-L 和CEACAM1-S，，CEACAM1-L 含外显 7，而 CEACAM1-S 在形成中外显子 7 被剪切。外显子 8 [TGA( S)]和外显子 9 [TGA(L)]为两个终止密码子，可以选择性使用，前者用于编码短胞质区，后者用于编码长胞质区。

小鼠,T细胞,迟发性超敏反应,大肠炎

然而与小鼠相比，CEACAM1-3L 亚型在人类 T 细胞中的功能机制有所不同。在小鼠上皮细胞中 CEACAM1-L 需要与 CEACAM1-S 一同起到抑制功能；而在人类 T细胞中， CEACAM1-L 能够单独在 TCR/CD3 复合物的 T 细胞中起到抑制效应。小鼠的 CEACAM1 和 N-端单克隆抗体的异源性结合能够特异性的抑制体内Th1/Th2 激酶的表达及免疫介导的体外淋巴细胞混合反应和体内半抗原介导的大肠炎模型迟发性超敏反应[20]。虽然这些证据能够清楚表明 CEACAM1 可以抑制 T细胞的功能，然而我们也要考虑到 CEACAM1 特异性抗体也具有共刺激作用[21,22它们是否具有阻断 CEACAM1 依赖的抑制信号或引起刺激级联反应的能力仍然需要证实。此外，通过转基因方法在 T 细胞内过表达 CEACAM1 剪接体（CEACAM1-4L）可以导致体内 T 淋巴细胞的抑制[23]。CEACAM1-L 的抑制特性可以直接影响 TCR-CD3 复合物的信号传递，抑制抗原特异性 CD4+T 细胞的激活（见图 2）。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R759

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