低代毛乳头细胞来源外泌体对毛囊再生及毛囊周期的影响及其机制的研究

发布时间：2020-05-26 22:59

【摘要】：背景和目的毛囊(HF)是哺乳动物一个复杂的小器官,由上皮和间充质成分相互作用而组成。毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)被认为是一种独特的间充质干细胞,具有自体干细胞治疗的潜力,位于毛囊底端的毛球部,被真皮鞘和毛母质细胞包绕。DPCs作为HF的信号中心,在调节毛发生长、形成和循环中发挥重要作用。外泌体(exosome or extracellular vesicles,EV)是由不同细胞类型分泌的纳米囊泡,它们本身携带大量生物信息:如调节蛋白、mRNA和microRNA(miRNA)。干细胞来源的外泌体具有类似干细胞的功能,在多种病理模型中起积极的治疗作用,且具有细胞疗法所不具备的优势。因此,我们在本实验中通过体内和体外实验验证DP来源的外泌体(DP derived exosome,DP-Exo)在部分损伤毛囊中的作用并验证其对毛囊周期的影响,最后,通过对外泌体miRNA测序和生信分析,进一步研究DP-Exo作用靶点基因及其相关通路,探讨其作用机制。方法1.人DPCs来源的外泌体对人毛母质细胞的作用利用显微解剖法联合酶消化法分别提取培养人的毛乳头细胞,收集低代毛乳头细胞(P1-P3)的条件培养基,通过高速离心法提取人DPCs来源的外泌体,将不同浓度的外泌体加入到人毛母质细胞培养基中,用CCK8增殖试验检测毛母质细胞增殖情况,并进行免疫荧光、划痕实验、细胞周期检测,评估外泌体在体外对毛母质细胞的生物学活性和特性的影响。2.小鼠DPCs来源的外泌体对小鼠HFSCs的作用利用显微解剖法和酶消化法获取小鼠的毛囊干细胞并进行培养。将小鼠毛乳头细胞外泌体以不同的浓度梯度加入到毛囊干细胞培养基中,观测小鼠DPCs来源的外泌体对小鼠毛囊干细胞增殖、迁移活性的影响。3.小鼠毛乳头细胞来源的外泌体对部分损伤后的毛囊再生的影响构建部分损伤毛囊再生动物模型:取C57小鼠触须垫,分离单根生长期鼠须毛囊,将进行下三分之一横断后的上三分之二横断毛囊移植入裸鼠背部中线左侧皮下,完整毛囊作为对照移植入背部中线右侧皮下。对模型分别用低代小鼠毛乳头细胞,低代DP-Exo和PBS进行干预,30天后观测横断毛囊再生情况并进行HE染色。4.毛乳头细胞来源的外泌体对毛囊生长周期的影响取7周龄C57雌性小鼠,进行背部脱毛,每隔2天注射小鼠毛乳头细胞来源的外泌体,局部涂抹米诺地尔作为阳性对照,PBS注射作为阴性对照,每隔7天观测鼠背毛囊生长情况,并取材做组织学检测,评估毛囊生长周期。5.毛乳头来源的外泌体生发作用的机制探讨提取小鼠毛乳头细胞外泌体miRNA,并送检做miRNA高通量测序,检测外泌体miRNA成分并进行定量,利用miRWalk 2.0和DAVID 6.8生信分析软件进行miRNA靶基因预测,利用GO和KEGG基因富集通路,并用STRING database数据库进行靶基因相关蛋白互作分析,并筛选出外泌体miRNA作用的关键通路靶基因。免疫荧光染色检测外泌体干预后再生毛囊干细胞标记物变化,细胞增殖情况,利用RT-PCR,Western-blot和免疫荧光检测关键靶基因在治疗中期和末期的表达情况的变化。结果1.外泌体促进毛母质细胞的增殖,迁移细胞周期测试以及Ki67免疫荧光结果提示:人来源的DP-Exos被毛母质细胞摄取后,能显著促进毛母质细胞的增殖,其中10μg/ml的外泌体具有最强的促毛母质细胞增殖的作用。划痕实验实验结果提示,DP-Exos能显著促进毛母质细胞的迁移能力,其中10μg/ml浓度的外泌体作用效果最为显著。2.DPCs来源的外泌体对毛囊干细胞的作用CCK-8和Ki67免疫荧光提示:10μg/ml小鼠来源外泌体能显著促进小鼠HFSCs的增殖。Transwell迁移实验结果提示:10μg/ml小鼠来源外泌体能显著促进小鼠HFSCs的迁移。3.小鼠DP-Exo对部分损伤的毛囊再生的影响上三分之二横断毛囊移植30天后有一定几率获得再生,再生率低且再生毛乳头小,再生毛囊细小,上三分之二横断毛囊移植并用毛乳头细胞和毛乳头来源外泌体干预后毛囊再生率显著提高,细胞治疗组和外泌体治疗组间无显著性差异。用Dil标记毛乳头细胞和外泌体,治疗后30天进行荧光示踪,结果为发现:移植的毛乳头细胞大部分整合于真皮鞘,少量进入毛乳头内部,毛乳头移植组和外泌体注射组毛乳头里可以看到Dil点状荧光信号。4.毛乳头细胞来源的外泌体对毛囊生长周期的影响DP-Exo治疗开始后14天内显示超过80%的毛干长出皮外,毛囊完全再生,到第21天几乎完全毛发再生。米诺地尔治疗组21天毛发再生率约为77%,而PBS组为35%。在14天时,DP-Exo是米诺地尔组背部毛发覆盖率的3.8倍,是对照组14倍。治疗21天后DP-Exo治疗组皮肤厚度高于米诺地尔组和PBS组。5.毛乳头来源的外泌体生发作用的机制探讨miRNA高通量测序定量分析得出Top30外泌体miRNA,GO富集到66个关键靶基因,KEGG富集到41条通路。PPI蛋白互作结果显示:Wnt5a,BMP2和BMP4为关键的中枢基因。免疫荧光实验结果提示,外泌体治疗中期和晚期,再生毛囊中K15、CD34阳性细胞显著增加,免疫荧光、Wb和RT-PCR等实验结果提示,关键通路基因Wnt5a,BMP2和BMP4表达量较对照组显著下调。结论1.低代毛乳头来源的外泌体能促进毛母质细胞的增殖迁移。2.代毛乳头来源的外泌体能促进毛囊干细胞增殖迁移。3.DP-Exo能促进部分损伤的毛囊再生。4.DP-Exo能促进毛囊由休止期向生长期转换。5.DP-Exo通过其携带的miRNA影响毛囊信号通路,通过作用于Wnt5a,BMP2,BMP4等关键通路基因,下调相关毛囊抑制信号蛋白从而促进毛囊再生和进入生长期。
【图文】：

细胞培养３天后显微镜下观察可见：ＤＰＣｓ呈同心圆聚集性生长。同心圆中逡逑间是折光性差、体积下的未迁出毛乳头，周围围绕迁出及增殖的毛乳头细胞。逡逑ＤＰＣｓ呈半透明的长梭形，人ＤＰＣｓ比小鼠ＤＰＣｓ体积稍大（图１－１）。ＤＰ在接种逡逑后３天后完全贴壁，且部分ＤＰ周围可见少量细胞迁出，迁出的ＤＰＣｓ呈长梭形逡逑或多边形，继续培养会有更多细胞迁出并增殖（图Ｍ），外观类似于真皮成纤维逡逑细胞，排列方式为同心圆状。ＤＰＣｓ特异性标记物为ＡＬＰ、Ｖｅｒｓｉｃａｎ、ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ逡逑等，因此我们利用免疫荧光共染的方法将Ｐ３代小鼠ＤＰＣｓ共染ＡＬＰ与ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ，逡逑结果显示ＡＬＰ（红色）与ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ（绿色）共同定位于毛乳头细胞（图１－２）。逡逑－＾＾ｒｍＢＴＯｎ＇Ｗｒ邋ｆ？逡逑阁１－１．小鼠触须（左）及人毛囊（右）ＤＰＣｓ的体外原代培养及观察。比例尺＝５００叫！。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｔｈｅ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｈｕｍａｎ（ｌｅｆｔ）邋Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ邋ｍｉｃｅ邋ｖｉｂｒｉｓｓａｅ邋（ｒｉｇｈｔ）邋ｄｅｒｍａｌ逡逑ｐａｐｉｌｌａ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ．邋；Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒｓ＝５００＾ｍ．逡逑１１逡逑

来源,毛母质,细胞内,体能

２．邋ＤＰＣｓ来源的外泌体提取、鉴定逡逑我们采用高速离心法分离得到外泌体，外泌体在电镜下观察室圆形或者杯逡逑状结构（图２Ａ，Ｂ）。粒径检测发现外泌体直径在５８．８－２５５．０邋ｎｍ之间，平均直逡逑径为９１．３±１８＿（图２0。外泌体表面标记物从０（，０９，能被＿检测到，而逡逑细胞成分标记物ｃａｌｎｅｘｉｎ却不能。此外，我们还能再外泌体中检测到毛乳头分泌逡逑的调节蛋白基质金属蛋白酶３邋（ｍａｔｒｉｘ邋ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ邋３，ＭＭＰ３）（图２Ｅ）。逡逑为了证明外泌体能被毛母质细胞摄取利用，我们将人毛母质细胞转染ＧＦＰ绿色逡逑突光蛋白，ＤＰ－Ｅｘｏ用Ｄｉｌ标记。将外泌体以不同量加入含４ｍｌ全培液的毛母质逡逑细胞并孵育４８ｈ观察，红色荧光标记的外泌体能在毛母质细胞内聚集，，细胞内逡逑外泌体聚集表现为浓度依赖性，加入４0ｎｇ邋（浓度ｌ0ｎｇ／ｍｌ）的外泌体培养组中，逡逑细胞内
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R758.71

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