TRPV1在角质形成细胞释放炎症介质中的作用及药物的干预研究

发布时间：2020-05-27 23:03

【摘要】： 皮肤是机体最大的器官。角质形成细胞是其主要组成成分,是保护体内器官免受外界环境有害物质刺激的重要生理屏障。大量研究显示角质形成细胞在一些炎症性皮肤病的发病机制中发挥重要作用。一旦受到外界因素和细胞因子的刺激,皮肤角质形成细胞能分泌多种炎症因子,从而积极地参与机体炎症和免疫反应。如角质形成细胞参与变应性接触性皮炎发生、发展的全过程。在一些遗传因素相关的皮肤病,如特应性皮炎,角质形成细胞成分可作为免疫佐剂参与疾病发生,并分泌过量的趋化因子和细胞因子,影响细胞生长与分化,也可以通过自分泌和旁分泌机制影响皮肤中其他细胞,促进疾病发生与发展。 TRPV1(transient receptor potential vanilloid receptor-1)是TRP家族成员,是一种钙通道蛋白,人和大鼠的TRPV1已经被克隆。最初的研究发现TRPV1是表达于外周初级传入神经元上重要的伤害感受器,参与了急性炎症痛敏的形成。TRPV1可以被内源性、外源性香草醛类物质,热刺激,酸,炎症刺激和组织损伤等激活。TRPV1不仅存在于神经元细胞,还广泛存在于非神经细胞上,例如呼吸道上皮细胞,心肌细胞,膀胱上皮细胞,胃壁上皮细胞和角质形成细胞。角质形成细胞中TRPV1受体的功能尤其是在皮肤神经网络中的作用受到重视,因此也被看作是开发抗炎和镇痛药物的新的靶点。多种伤害性刺激通过直接诱导角质形成细胞,触发了表皮的炎症反应,升高了致炎因子和缓激肽等炎症介质的水平。在人表皮角质形成细胞中TRPV1的活化能直接导致环氧酶-2的释放。研究发现,在人的鼻、气管和肺上皮细胞中TRPV1在辣椒素(CAP)的作用下活化,能够介导人上皮细胞中IL-6基因和蛋白表达水平的上调。说明TRPV1可能在角质形成细胞等非神经细胞分泌炎症因子参与炎症反应过程中发挥重要作用。针对TRPV1的药物研究也将为皮肤炎症性疾病的治疗带来新的前景。 为揭示角质形成细胞表达TRPV1的生物学功能,我们检测了分离的人角质形成细胞和HaCaT细胞炎症介质表达与TRPV1之间的关系。同时还研究了TRPV1活化后细胞内钙离子的变化。利用瞬时转染和双荧光素酶检测技术探讨了TRPV1活化与NFκB活化的关系。在此基础上,考察了临床用于抗炎镇痛的皂苷类活性成分对TRPV1表达及炎症介质分泌的影响。 主要研究结果如下: 1. TRPV1mRNA在人角质形成细胞中有表达,且在CAP刺激下表达增加。经ELISA法检测,CAP显著升高了致炎因子IL-8和PGE2的表达水平,且呈剂量依赖性。8μmol/L CAP可以使角质形成细胞IL-8显著升高62.75%,使PGE2升高54.73%。这种作用能够被TRPV1受体拮抗剂CPZ抑制,说明TRPV1活化促进了致炎因子的表达。 2.经流式细胞仪检测荧光探针的方法,发现2～16μmol/L CAP能剂量依赖性增加HaCaT细胞内钙离子浓度。而3μmol/L CPZ、10μmol/L CPZ和20μmol/L CPZ分别使CAP刺激升高的荧光强度降低了32.11%、38.33%和34.66%。CPZ的抑制作用表明,TRPV1活化导致胞内钙离子浓度的改变。 3.经流式细胞仪和western blot方法鉴定,成功构建了能够稳定表达TRPV1蛋白的HEK293T细胞株。利用该细胞株研究证实,TRPV1介导了CAP刺激HEK 293T-TRPV1细胞内钙离子浓度升高,主要是细胞外钙离子内流的结果。 4.利用瞬时转染及双荧光素酶检测技术,将pNFκB和pRL-TK质粒共同转染HEK293T细胞、HaCaT细胞和HEK 293T-TRPV1细胞,比较三种细胞经CAP刺激后NFκB的活化水平。结果表明CAP能够显著增强经瞬时转染的HaCaT细胞和HEK 293T-TRPV1细胞中NFκB转录活性,而HEK293T细胞中无明显变化。TRPV1受体拮抗剂能够抑制CAP诱导NFκB活化的作用,说明TRPV1活化后进一步通过信号的传递诱导了NFκB的激活。 5.利用特异性PI3K和MAPK信号途径抑制剂,分别阻断该两条信号传导通路,发现PD98059、Wortmannin分别使HEK 293T-TRPV1细胞的NFκB转录活性降低了52.42%、24.52%,经统计分析,有显著差异(P0.05)。说明TRPV1活化促进NFκB激活的作用与MAPK和PI3K信号传递途径有关。 6.人参皂苷Rb1能够显著降低HaCaT细胞中CAP诱导的TRPV1 mRNA表达,抑制对NFκB的活化作用,使炎症因子IL-8、IL-6和PGE2的分泌水平分别下降26.72%、38.23%和57.01%。在HEK293T-TRPV1细胞株中,Rb1能够显著降低CAP诱导细胞内钙离子浓度,特异地抑制CAP诱导的NFκB活化。由此可见,Rb1能够抑制TRPV1受体而发挥作用。 7.芍药苷(PF)能够显著降低CAP升高的IL-8、IL-6、PGE2水平,下降了11.39%、51.96%。75.98%。比较PF对HaCaT细胞和HEK293T-TRPV1细胞株经CAP诱导升高的细胞内钙离子的干预作用,表明PF可能存在其他的通道影响钙离子内流,而不是直接与TRPV1相关的。 8. CAP对细胞分泌TNFα影响不显著。三七皂苷R1和人参皂苷Rg1对CAP依赖的TRPV1受体活化、钙离子内流及信号传递通路没有明显干预作用。 9.经二维电泳分析和MALDI-TOF-MS鉴定发现,CAP刺激HaCaT细胞表达差异蛋白有磷酸甘油醛异构酶,烯醇化酶1和角蛋白14,其在TRPV1活化后致炎症介质表达中的作用,有待于进一步研究。
【图文】：

35pTRPV1eGFP 为 7266bp （图 2.2 ）。图2.2 ：质粒电泳图M: marker; 1: pTRPV1; 2: pTRPV1-GFP; 3: pEGFP-N1Fig 2.2 . Electrophoresis results of pTRPV1 and pTRPV1eGFP constructs. Lane M and lane1-4represents marker, pTRPV1, pTRPV1eGFP and pEGFP-N1 plasmid expression vectorrespectively.1. 2 TRPV1 表达载体的鉴定测序结果在GenBank中采用BLAST程序进行序列同源性分析的结果表明，该序列与 NCBI Gene 中报道的 Trpv1 transient receptor potential cation channel,subfamily V, member 1 （Rattus norvegicus，GeneID: 83810）同源性为 100％。TAGGACCCGGTGACGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTGGATCCCGGGCCCCTTTCTCCCCTGGGACCATGGAATCCTTGAAAACCTCAGCATCCTCTGGCTTAAGGGATCCCGTATAATGCTTCAGTTGAACTTCTTCCTGCTGGGTGGCATGTCTATCTCGAGTGCTTGCATCCCTCAGAAGGGGAACCAGGGCAAAGTTCTTCCAGTTTCTCCCTGAAACTCGGCCTGACCTCAGGGAGAAGCTCAGGGTGCGCTTGACGCCCTCACAGTTGCCTGGGTCCTCGTTGATGATACCCACATTGGTGTTCCAGGTAGTCCAGTTTACCTCGTCCACCCTGAAACACCACCGGTAGTCATCCTTGCCGTCAGGAGTGAACCCCACCTGCAGCAGCTTGCCAGAGCGGAAGGCCTTCCTCATGCACTTCAGGAAGCTCTTCTCTGTATCCAGGATGGTGATGGCTCTCTGCAGCTTCCAGATGTTCTTGCTCTCTTGTGCAATCTTGTTGACGGTCTCACCCATGAGAGCAATGAGCATGTTGAGCAGAAGGATGTAGGTGAGAATCACATAGGCCAGTAACAGGATGATGAAGM 1 2 32501,0002,5005,0007,50010,00015

染了含 GFP 荧光蛋白质粒的细胞，转染效率约为 30%（图 2.3 A,B）。细胞经G418 筛选 2 周后，，置荧光显微镜下观察，可见转染了绿荧光蛋白质粒的细胞数目显著增多。经 4%多聚甲醛溶液固定的细胞片于激光共聚焦显微镜下观察（图 2.3 C，D）。可见，带有绿荧光蛋白的质粒已经转染至细胞，并在膜上表达。A．对照质粒 pEGFP-N1 转染 293T 细胞（转染后 24h）B．质粒 pTRPV1eGFP 转染 293T 细胞（转染后 24h）（×40）
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R751

【引证文献】

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1 王耀帅;艾灸以温促通效应与TRPV1的相关性研究[D];南京中医药大学;2012年

本文编号：2684284