从噬菌体抗体库筛选人源性抗IL-8抗体

发布时间：2020-06-11 15:02

【摘要】：银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其病因复杂，各种内外因素共同参与其发病机制。银屑病患者具有明显的免疫学异常，多种细胞因子作为主要的效应分子参与银屑病的病理过程。 IL-8是银屑病患者体内一种主要的异常表达的细胞因子。角质形成细胞、单核细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞等是银屑病患者体内主要的IL-8来源，而IL-8受体则广泛地分布于银屑病患者的角质形成细胞、中性粒细胞、T细胞和肥大细胞。在银屑病的病理过程中，IL-8既作为启动分子趋化中性粒细胞、淋巴细胞等向皮肤移行和浸润，促进其他细胞因子的分泌，又作为效应分子直接刺激角质形成细胞增殖，并促进真皮浅层血管的增生。因此通过抗体阻断IL-8与受体之间的作用有可能对银屑病具有治疗效果。噬菌体抗体库技术通过将全套抗体基因展示在噬菌体表面，为此便可以方便地利用不同抗原筛选相应的抗体，这不仅是一种制备人源性抗体的有效方法，而且大容量、具有良好多样性的抗体库，对获得高亲和力的抗体以及在对抗体性能进行改造方面具有较强的优势。噬菌体抗体库技术已经成为抗体工程领域的关键技术之一。以噬菌体抗体库技术为第四军医大学硕士学位论文技术平台制备人源性抗IL一8抗体有可能为银屑病的治疗带来新的希望。 IL一8一His融合蛋白原核表达载体PRSET-IL一8经常规氯化钙法转化 BLZI(DE3)大肠杆菌感受态细胞，挑单克隆于LB培养基中培养。待细菌生长至半对数期时加入IPTG诱导蛋白表达。细菌沉淀经超声裂菌后过 0.45 pm滤膜，取上清对PBS透析过夜。透析后的上清以His抗体免疫亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白经PBS透析后以SDS一PAGE电泳鉴定纯化效果。结果表明，在30℃低温诱导表达的情况下，IL一8一His融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达于细菌周质腔中，，经SDS一PAGE电泳鉴定表明，纯化后的蛋白在分子量约11 000大小处呈单一条带。经分光光度计粗定量测得IL一8一His融合蛋白的浓度约为1.59几。纯化后的IL一8一HIS融合蛋白以包被缓冲液稀释后固相化至抗原管，以BSA/PBS封闭后加入噬菌体抗体库孵育，用含O，05%吐温的PBS洗涤后加入半对数生长期的XL-Blue细菌。感染巧min后取适量铺于含氨节青霉素的LB平板测定滴度，其余菌液扩大培养。在氨节青霉素和卡那霉素的压力选择下，加入辅助噬菌体VCSM诱导噬菌体抗体扩增。次日浓缩噬菌体抗体即次级库，用于下一轮筛选。共进行3轮筛选，每轮筛选均测定次级库的滴度，并计算噬菌体抗体的投入产出比(回收率)作为特异性噬菌体抗体富集的指标。在第3轮筛选后，从含氨节青霉素的 LB平板上挑单克隆于SB培养基中振荡培养，于半对数生长期加入辅助噬菌体 VCSM诱导噬菌体抗体表达，离心收集上清即为噬菌体抗体上清。以 lL一8一His融合蛋白包被ELISA板，依次加入待测噬菌体抗体上清及H即- 羊抗M13抗体，最后以OPD底物显色。显色阳性的克隆再以IL一8一His 融合蛋白、人IgG、表皮角蛋白、BSA和His蛋白为抗原分别包被ELIsA 板，鉴定抗原、抗体反应的特异性。经过3轮筛选，噬菌体抗体的回收率得到约300倍的富集。最后一轮筛选后挑取的60个单菌落制备噬菌体抗体，经ELISA检测第2株和第23株克隆与IL一8一His融合蛋白具有结合第四军医大学硕士学位论文活性，而与人IgG、表皮角蛋白等无关蛋白均无结合活性，表明所获得的噬菌体抗体具有较高的特异性。测序结果表明，克隆2和克隆23的VH 基因均属于人免疫球蛋白VH3亚群，V入基因则分别属于V入DPLS和 V入DPLZ亚群。 IL一8作为与银屑病密切相关的细胞因子，被认为是治疗银屑病的靶点之一，然而目前的临床资料却显示了两种抗IL一8抗体迥然不同的治疗效果，因此抗IL一8抗体对银屑病的治疗作用尚无法评价。改变抗IL一8抗体的应用方式，开发穿透性更强的小分子抗体、特异性更强的抗IL一8/抗角蛋白双特异性抗体，对抗体进行人源化和提高抗体的亲和力等有可能提高抗IL一8抗体治疗银屑病的疗效。本研究通过噬菌体抗体库技术制备了抗IL一8单链抗体，有望通过直接应用或进一步构建抗IL一8/抗角蛋白双特异性双链抗体，从而达到治疗银屑病的目的。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R758.63

【参考文献】