沙眼衣原体E型MOMP的克隆表达与初步鉴定

发布时间：2020-06-12 11:34

【摘要】： 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,C.t)所致的泌尿生殖道感染近几年迅速增多,无症状和慢性C.t感染所致的前列腺炎、不孕不育、异位妊娠、慢性盆腔炎等严重危害着患者的身心健康。目前,C.t泌尿生殖道感染的迁延难治、易于复发和耗资巨大已成为共识,对C.t感染的研究已成为当今国内外研究的热点之一,C.t的预防和控制方法亟待改进。沙眼衣原体疫苗的研究便是预防措施中的重点之一。已有的研究表明沙眼衣原体主要外膜蛋白(major outer membraneprotein,MOMP)表位决定了保护性抗体的产生,并且特异性的作为抗体的靶抗原。其相对分子质量为40×10~3,是衣原体外膜复合物的主要成分,占外膜总蛋白的60%以上,因此人们研究最多的蛋白疫苗是MOMP。 目的:构建ompl-pGEX6p-1重组质粒,诱导表达C.t E型MOMP并行初步鉴定。 方法:提取C.t E型MOMP染色体DNA作为模板,设计引物扩增出完整的omp1基因,与载体pGEX6p-1经双酶切后连接重组,转化至大肠杆菌BL-21;重组子经抗生素平板筛选后,挑取生长的单菌落培养至对数生长期并提取重组质粒,限制性核酸内切酶BamHI,NotI双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。IPTG诱导融合蛋白表达,细菌裂解物离心的上清和沉淀分别行SDS-PAGE电泳。以抗谷胱甘肽抗体(anti-GST-tag antibody)作为一抗行Western—blotting技术初步鉴定。 结果:PCR扩增产物在1200bp位置出现明显条带,并经测序鉴定与Genebank上提供的E型C.t omp1基因全序列同源性达99.92%,氨基酸序列同源性达100%,证明C.t E型omp1基因扩增成功。omp1-pGEX6p-1重组质粒经双酶切鉴定,分别在5000bp及1200bp位置出现条带,初步证明重组质粒构建成功。诱导后得到53KD蛋白,并可被GST特异性抗体检测,重组质粒测序证明736位碱基发生突变出现终止密码子,表达提前终止。 结论:(1)扩增到完整的C.t E型omp1基因,并成功构建了omp1-pGEX6p-1重组质粒;(2)重组质粒诱导后可表达53KD的蛋白,该蛋白可被GST特异性抗体结合;(3)重组质粒与标准omp1基因序列比对结果理论上证明,目的蛋白具有一定的免疫原性。
【图文】：

天津医科大学硕士学位论文结果Ex6p一l重组质粒的构建ompl基因的pCR扩增性酶切位点的Pl、P2引物和高保真几qDNA聚合酶PcR因，取5林1pCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳，在约1200bp带，，结果见图1:

图1c.tE型完整omPI基因的扩增M;DNAMarker;1ompl扩增产物;2阴性对照。粒的提取提取pGEX6P一1质粒后取5闪直接电泳，用1%琼in，可以见到质粒被成功提取出来，电泳呈三条清晰
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R759

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本文编号：2709471