HMGB1诱导角质形成细胞增殖和释放IL-18在银屑病发病中的作用和机制研究

发布时间：2020-06-19 03:50

【摘要】：背景:银屑病是皮肤科常见的慢性炎症性皮肤病,患者的皮损常表现为红斑基础上的鳞屑,伴严重瘙痒,极大地损害患者的身心健康。在银屑病中,以T淋巴细胞为主的免疫细胞浸润于皮肤局部,释放TNF-α、IFN-γ、IL-17等细胞因子诱导炎症反应,最终作用于表皮角质形成细胞使其过度增殖,是银屑病发病的下游核心事件,亦是其病理表现为表皮增生的直接原因。然而近年来的研究表明,角质形成细胞不仅是银屑病炎症反应的下游效应细胞,亦可在活化后发挥固有免疫功能,释放细胞因子和趋化因子,参与皮损炎症反应的发展和维持。目前,银屑病中角质形成细胞的活化机制尚不完全清楚,仍有待进一步阐明。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一种几乎表达于所有种类细胞的细胞核内蛋白,在生理状态下发挥维护基因组稳定性、调控基因转录表达等功能。当细胞受到各种内外源性刺激时,HMGB1可由细胞核释放至细胞浆并进一步分泌至细胞外,发挥损伤相关分子模式(DAMP)作用,通过与固有免疫细胞膜上相应的模式识别受体结合活化细胞,激活核因子活化B细胞κ轻链增强子(NF-κB)通路等炎症相关信号通路,促进炎症因子的产生与释放,导致炎症反应的发生。此外,细胞外HMGB1亦可通过结合相应受体,促进多种组织类型细胞的增殖。迄今为止,研究者们已经证实HMGB1可通过发挥DAMP促炎因子效应参与多种感染性疾病(如脓毒血症)及自身免疫病(如类风湿性关节炎)的发病,但其在皮肤炎症性疾病中的作用此前少有报道。近期有研究发现HMGB1在银屑病皮损表皮角质形成细胞中存在释放,且其血清水平与银屑病患者病情严重程度呈正相关,提示HMGB1可能参与银屑病的发病;而我们课题组前期研究发现,3种HMGB1相关模式识别受体——RAGE、TLR2、TLR4在银屑病表皮角质形成细胞膜上表达水平升高。基于此,我们提出本课题研究假说:银屑病中由角质形成细胞释放的HMGB1以自分泌方式结合角质形成细胞膜上相应模式识别受体,激活NF-κB等信号通路,活化角质形成细胞增殖和固有免疫功能,促进炎症因子的释放,参与银屑病的发生发展。目的:阐明HMGB1活化角质形成细胞的效应及其分子机制,并明确HMGB1调控角质形成细胞增殖和固有免疫功能在银屑病发病中的作用。方法:1.HMGB1影响角质形成细胞增殖的作用与机制分析:首先,使用重组人HMGB1蛋白(rhHMGB1)刺激人原代角质形成细胞(NHKs),CCK8检测NHKs的增殖水平;接着,利用免疫荧光和Western Blot验证rhHMGB1刺激后NHKs中NF-κB p65通路的活化;随后,使用p65 siRNA干涉片段转染NHKs,荧光定量PCR检测rhHMGB1刺激后NHKs中miR-17-92簇表达水平;最后,使用miR-17-92 siRNA干涉片段转染NHKs,CCK8、Western Blot、流式细胞术分别检测rhHMGB1刺激后NHKs的增殖水平、细胞周期蛋白表达水平及细胞周期分布。2.HMGB1影响角质形成细胞固有免疫功能的作用与机制分析:首先使用rhHMGB1刺激NHKs,PCR-array筛选表达水平变化的炎症因子,荧光定量PCR验证PCR-array结果,Western Blot和ELISA分别检测rhHMGB1刺激下NHKs中白介素-18(IL-18)的蛋白水平和分泌水平;接着,使用p65 siRNA干涉片段转染NHKs,荧光定量PCR、Western Blot、ELISA分别检测rhHMGB1刺激后NHKs中IL-18的mRNA水平、蛋白水平和分泌水平,染色质免疫共沉淀验证rhHMGB1刺激后p65与IL18基因启动子区的结合;随后,利用Western Blot观察rhHMGB1刺激后NHKs中caspase-1炎性体的活化及IL-18的成熟体水平,免疫共沉淀验证rhHMGB1刺激下NHKs中炎性体的组装;最后,使用caspase-1 siRNA干涉片段转染NHKs,Western Blot和ELISA分别检测rhHMGB1刺激后NHKs中IL-18的成熟体蛋白水平和分泌水平。3.HMGB1参与银屑病样小鼠皮炎形成的作用与机制分析:首先,构建咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型,给予HMGB1或IL-18中和抗体及相应同型对照预防性干预,观察各组小鼠背部皮损炎症程度,游标卡尺测量各组小鼠耳部皮损厚度,HE切片染色观察各组小鼠皮损组织学特征,免疫荧光检测各组小鼠皮损局部CD3~+T细胞浸润数目,流式细胞术检测各组小鼠外周血Th1和Th17细胞比例,免疫荧光观察各组小鼠皮损IFN-γ和IL-17阳性细胞数目,ELISA检测小鼠血清IFN-γ和IL-17水平;随后,分离小鼠皮损表皮,荧光定量PCR检测各组小鼠表皮IL-18 mRNA水平,Western Blot观察各组小鼠皮损表皮NF-κB p65活化程度、caspase-1成熟体水平、IL-18前体和成熟体水平,免疫共沉淀观察炎性体的组装,ELISA检测各组小鼠血清IL-18水平;最后,给予构建完成的银屑病样小鼠模型HMGB1或IL-18中和抗体治疗,并再次进行前述相关皮炎严重程度指标评估。4.银屑病角质形成细胞中HMGB1的释放机制分析:首先,使用重组人IFN-γ蛋白刺激NHKs,免疫荧光观察HMGB1定位,Western Blot观察NHKs细胞浆和细胞核中HMGB1水平及STAT1通路活化水平,ELISA检测HMGB1分泌水平;随后,使用STAT1 siRNA干涉片段转染NHKs,Western Blot验证干涉效率并检测rhHMGB1刺激下NHKs细胞浆和细胞核中HMGB1水平,免疫荧光观察HMGB1的定位,ELISA检测HMGB1分泌水平。结果:1.HMGB1通过诱导miR-17-92簇表达促进角质形成细胞增殖:首先,CCK8实验证实rhHMGB1可显著促进NHKs增殖;随后,利用Jaspar在线生物信息学数据库预测发现与银屑病角质形成细胞增殖相关的miR-17-92簇编码基因启动子区存在NF-κB p65转录因子结合位点,利用免疫荧光和Western Blot明确rhHMGB1能够活化NHKs中NF-κB p65通路,并证实rhHMGB1可通过NF-κB p65通路诱导NHKs中miR-17-92簇表达水平上调;最后,我们发现rhHMGB1促进NHKs增殖的作用由miR-17-92簇介导,且rhHMGB1可通过上调miR-17-92簇抑制NHKs中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制子2B(CDKN2B)的表达,并促进NHKs细胞周期进展。上述结果表明,HMGB1可通过激活NF-κB p65通路诱导miR-17-92簇的表达,从而促进角质形成细胞的增殖和细胞周期进展。2.HMGB1通过活化NF-κB p65通路促进角质形成细胞中IL-18的表达:首先,利用PCR-array发现rhHMGB1刺激可促进NHKs中多种炎症因子mRNA表达水平升高,其中IL-18上调倍数最高,利用Western Blot和ELISA明确rhHMGB1可升高NHKs中IL-18的蛋白水平和分泌水平;而转染NF-κB p65 siRNA干涉片段后,rhHMGB1上调NHKs中IL-18 mRNA水平、蛋白水平和分泌水平的效应显著减弱;最后,染色质免疫共沉淀证实rhHMGB1能够促进NHKs中p65与IL18基因启动子区的转录结合。以上发现说明,HMGB1可通过活化NF-κB p65通路转录激活角质形成细胞中IL-18的表达。3.HMGB1通过活化炎性体促进角质形成细胞中IL-18的释放:首先,利用Western Blot证实rhHMGB1刺激NHKs后,炎性体效应分子caspase-1和IL-18成熟体表达水平升高;接着,免疫共沉淀发现rhHMGB1能够诱导caspase-1与炎性体连接分子含CARD域凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的结合;而转染caspase-1 siRNA干涉片段后,rhHMGB1促进NHKs中IL-18成熟与分泌的作用显著减弱。上述发现提示,HMGB1通过活化炎性体促进角质形成细胞中IL-18的成熟与释放。4.HMGB1-IL-18轴通过促进Th17型免疫反应参与咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮炎形成:首先,给予咪喹莫特小鼠HMGB1或IL-18中和抗体预防性干预,可显著缓解小鼠背部皮损红斑、鳞屑程度,抑制小鼠耳部增厚;同时,HE染色观察到HMGB1和IL-18中和抗体组小鼠皮损表皮显著变薄,免疫荧光实验提示HMGB1和IL-18中和抗体可减少小鼠皮损CD3~+T细胞数目;随后,流式细胞术发现HMGB1和IL-18中和抗体可降低小鼠外周血中Th17细胞比例而对Th1细胞比例无影响,ELISA发现中和抗体干预组小鼠血清IL-17水平下降而IFN-γ水平无变化,免疫荧光实验证实中和抗体干预组小鼠皮损中IL-17阳性细胞数目减少,而IFN-γ阳性细胞数目无变化;最后,分离小鼠皮损表皮后检测发现HMGB1中和抗体组小鼠皮损表皮NF-κB p65通路和炎性体活性降低且IL-18的mRNA和蛋白水平下降,ELISA实验观察到HMGB1中和抗体组小鼠血清IL-18水平降低。上述结果说明,HMGB1-IL-18轴可通过促进Th17型免疫反应促进咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮炎形成。5.HMGB和IL-18中和抗体促进咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎缓解:在银屑病样小鼠模型构建完成后,停止咪喹莫特涂抹同时给予HMGB1或IL-18中和抗体治疗性干预,发现各组小鼠背部皮损红斑、鳞屑在咪喹莫特停用后均出现显著缓解;而相比于同型对照组,HMGB1和IL-18中和抗体组小鼠耳部厚度可进一步变薄,HE染色示中和抗体组小鼠皮损表皮厚度降低,免疫荧光示HMGB1和IL-18中和抗体可显著抑制小鼠皮损CD3~+T细胞数目。上述结果说明,HMGB1和IL-18中和抗体能够促进咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮炎缓解。6.IFN-γ通过STAT1通路促进角质形成细胞释放HMGB1:首先,利用免疫荧光和Western Blot证实IFN-γ能够诱导角质形成细胞中HMGB1的核-浆转位,ELISA观察到IFN-γ刺激下角质形成细胞可分泌HMGB1;转染STAT1 siRNA干涉片段后,IFN-γ促进角质形成细胞HMGB1核-浆转位及分泌的效应显著减弱。以上发现提示,IFN-γ可通过活化STAT1通路促进角质形成细胞核内HMGB1释放至胞外。结论:银屑病中IFN-γ可诱导角质形成细胞释放HMGB1,后者通过结合角质形成细胞膜上相应的模式识别受体,一方面通过促进miR-17-92簇表达诱导角质形成细胞增殖,另一方面通过活化NF-κB p65通路和炎性体促进角质形成细胞表达和释放IL-18,并增强下游Th17型免疫反应,从而参与银屑病的发生发展。本课题首次阐明HMGB1在银屑病中调控角质形成细胞增殖和固有免疫功能的作用和机制,为角质形成细胞参与银屑病炎症反应形成的理论提供了新证据;HMGB1及其下游IL-18是银屑病治疗的潜在分子靶点,值得在未来的银屑病新药研发工作中予以关注。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R758.63
【图文】：

银屑病,临床表现,红皮病型银屑病,自身免疫性

文献回顾概述是皮肤科常见的自身免疫性皮肤病，以覆有鳞屑的瘙痒性红，在世界范围内患病率约为 2-4%[1]，据不完全统计，我国银]，且其发病率呈逐年上升趋势。依据皮损形态和其他临床表现为以下四类：寻常型银屑病（包括慢性斑块型银屑病和点滴状病、红皮病型银屑病及合并关节炎的关节病型银屑病。这其型银屑病，临床表现为好发于头部、躯干和四肢伸侧的边界，上覆大量鳞屑（图 1 左）；病理上主要表现为表皮角质形化异常及真皮层以淋巴细胞浸润为主的炎症反应（图 1 右）难，患者病情常迁延不愈，且常因瘙痒难忍、容貌受损等而，生活质量严重下降，并因长期治疗导致沉重的经济负担[3]。

角质形成细胞,银屑病

空军军医大学博士学位论文A 的翻译，甚至促进其直接降解，从而抑制靶基因的表达。早在 2007 年，就发现银屑病患者皮损中 miRNA 表达谱存在异常[18]，后续研究发现多个 miRN表达与银屑病表皮角质形成细胞的增殖活跃有关。例如，miR-125b 在银屑病低表达，失去对靶基因成纤维细胞生长因子受体 2（FGFR2）表达抑制，从而质形成细胞增殖[19]；miR-486-3p 亦在银屑病皮损中表达水平降低，导致其靶7 表达水平升高，参与角质形成细胞过度增殖[20]；另一方面，高表达的 miR-3过抑制蛋白磷酸酶 6（PPP6）的表达促进角质形成细胞周期进展从而诱导其。我们课题组在此前研究中也发现，miR-17-92——这一 miRNA 簇在银屑病表达升高，可通过抑制靶基因——细胞周期蛋白依赖性激酶抑制子 2B（CDKN进角质形成细胞的增殖[22]（图 2），是银屑病角质形成细胞过度增殖的重要机。

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