Nrf2在低剂量ALA-PDT治疗光老化成纤维细胞中的调控作用及机制研究

发布时间：2020-06-21 03:12

【摘要】：研究背景及目的:皮肤老化是一个复杂的生物学过程,它既包括随着时间或者遗传因素发生的内源性老化,也包含由环境因素如紫外线辐射等引起的光老化。由于紫外线中至少95%以上的长波紫外线(ultraviolet A,UVA)可到达地面,并且能深入地穿透表皮和真皮,长期紫外线辐射可导致皮肤粗糙、细纹、色素沉着、毛细血管扩张、真皮变薄、深皱纹等,甚至皮肤肿瘤形成。UVA辐射是引起皮肤光损伤和老化的最重要的环境因素之一。目前预防及治疗皮肤老化方式较多,包括防晒霜、护肤品、激光、注射、手术,光动力治疗等等。光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)是指在氧气及光敏剂的参与下,通过特定光源照射皮损部位产生活性氧等物质,发生氧化还原反应,从而达到治疗目的。光动力效应有两种机制,包括Ⅰ型和Ⅱ型反应。通过氢原子或电子转移产生除单线态氧以外的其它自由基或自由基离子,这些自由基再和生物分子以及氧气分子反应生成氧化产物,称为Ⅰ型反应。而通过能量转移主要产生高活性的氧化剂-单线态氧(~1O_2),~1O_2迅速与邻近的生物分子反应并造成损伤,这一过程称为Ⅱ型反应;两型反应可同时出现,最终达到损伤、破坏组织或细胞的作用。目前在皮肤疾病中,光动力疗法已得到广泛应用,治疗包括日光性角化病、尖锐湿疣、痤疮、鲍温病等疾病。近年来,低剂量光动力的嫩肤作用也逐渐被人们认识,成为一种新型无创、安全、经济、简便、重复性强的光老化治疗方式。较多的临床研究发现,高剂量光动力疗法通过在靶组织内产生大量具有细胞毒性的活性氧物质(reactive oxygen species,ROS),引发细胞凋亡从而达到杀灭肿瘤及微生物的作用;而低剂量光动力治疗光老化皮肤后其质地、肤色明显改善,其中作用机制尚不十分清晰,可能是产生少量ROS引起细胞损伤后修复,刺激成纤维细胞增殖,加速皮肤愈合,引起真皮胶原蛋白的增加和弹性纤维变性的减少,从而达到真皮重塑,胶原新生的效果。当紫外线长期辐射造成体内过多的活性氧累积,超出体内对氧化应激的抵御功能,产生光损伤或者光老化表现。核因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是一种核转录因子,与下游的抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合后形成Nrf2/ARE信号通路,该通路在细胞抗氧化应激反应中起着关键调控作用,控制一系列抗氧化和解毒酶,对光老化有保护和治疗作用。本文通过建立体外光老化细胞模型,探讨低剂量ALA(5-aminolevulinic acid)-PDT是否能够激活光老化细胞中Nrf2,产生抗氧化应激反应,达到治疗光老化的作用并研究其中的机制。方法:1.按照我科既往方法分离培养原代人包皮成纤维细胞;2.光老化细胞模型:以长波紫外线光源照射人成纤维细胞,制作人成纤维细胞光老化模型;3.通过实时无标记细胞分析仪(Real-Time Cell Analyzer,RTCA)检测细胞增殖情况;4.采用衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase SA-β-Gal)试剂盒检测UVA照射成纤维细胞后衰老细胞比例;5.倒置显微镜观察紫外线照射成纤维细胞后形态变化;6.采用SOD试剂盒检测ALA-PDT处理光老化成纤维细胞后细胞总SOD水平;7.核浆蛋白分离试剂盒检测不同剂量光动力处理后细胞核、细胞质中Nrf2蛋白水平变化;8.构建siNrf2腺病毒载体,扩增腺病毒并感染光老化的成纤维细胞,通过荧光显微镜观察感染效率,通过定量聚合酶链反应法(Quantitative polymerase chain reaction,qPCR)及免疫印迹法(Western blot,WB)检测Nrf2在mRNA和蛋白水平的沉默效率;9.用免疫印迹法分析ALA-PDT处理后的成纤维细胞中Nrf2、TGF-β1、HO-1、COL1、COL3、ERK、p-ERK和MMP-9蛋白表达变化。结果:1.成功制备光老化细胞模型:随着UVA剂量增大,显微镜下观察成纤维细胞形态变得宽大扁平,出现脱颗粒现象,甚至凋亡:实时无标记细胞分析仪检测细胞增殖减慢,当UVA剂量为10J/cm~2时,细胞经过一段时间增殖后出现停滞状态,当UVA剂量为20 J/cm~2细胞增殖受到明显抑制;SA-β半乳糖苷酶检测到衰老细胞阳性率与UVA呈剂量依赖关系。2.ALA-PDT处理光老化成纤维细胞后,Nrf2和相关因子表达的变化(1)细胞中总SOD活性均有所增高,但在低剂量(0.1mM ALA,21J/cm~2红光)光动力组升高最为明显;(2)核浆蛋白分离实验提示,低剂量(0.1mM ALA,21J/cm~2红光)光动力处理光老化细胞组中,Nrf2在细胞核表达明显增高;(3)WB结果显示,低剂量(0.1mM ALA,21J/cm~2红光)光动力组中p-ERK、Nrf2、转化生长因子1(TGF-β1)、血红素氧合酶-1(HO-1)及Ⅰ、III型胶原蛋白(COL1、COL3)表达上调,基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达有所下降;当腺病毒(Ad-siNrf2)感染成纤维细胞后,TGF-β1、HO-1表达下调,Ⅰ、III型胶原蛋白合成减少,基质金属蛋白酶MMP9表达增高。结论:1.采用UVA剂量为10J/cm~2,照射成纤维细胞,连续5天,可成功制备成纤维细胞光老化模型;2.在光动力疗法治疗光老化成纤维细胞中,低剂量光动力通过激活Nrf2相关的途径增强抗氧化能力,促进真皮胶原蛋白生成,减少其降解;敲低Nrf2表达后,细胞合成胶原减少,抗氧化水平下降,提示转录因子Nrf2在抗氧化、促进胶原增生中起着重要调控作用。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R758.1
【图文】：

图 2-1 UVA 照射对成纤维细胞形态的影响. Scale bar = 200 μm2.2.2 紫外线照射后 SA-β 半乳糖苷酶比率不同剂量 UVA 连续照射成纤维细胞 5 天后，随着 UVA 剂量增大，蓝染细胞逐渐增多，呈剂量依赖。实验中空白对照组衰老成纤维细胞阳性率为 17.68%，UVA 剂量为5、10、20J/cm2时阳性率分别为 33.09%、79.11%、73.25%，与空白对照组相比均有统计学差异（P＜0.005）。但当 UVA 剂量达 20J/cm2时，部分细胞收缩成团，出现凋亡现象，剩余细胞染色呈蓝染。（图 2-2）

陆军军医大学硕士学位论文.2.3 紫外线影响成纤维细胞增殖过RTCA 细胞实时分析系统发现 0-48h所有细胞增殖均呈上升趋势，无明 时，每组细胞 Cell Index(CI)分别为 2.89±0.13，2.75±0.13，2.04±0.11，1.90量为 0 J/cm2和 5 J/cm2两组间细胞增殖仍呈上升趋势，然而 UVA 剂量为J/cm2两组间细胞增殖开始出现停滞；在 144h 时，每组细胞 Cell Index(CI).48，6.14±0.39，1.74±1.071，0.015±0.045,随着时间延长,UVA 剂量增大,细响，与空白对照组相比均有统计学差异；当 UVA 剂量为 20 J/cm2时细胞抑制，增殖曲线负向影响,且结合倒置显微镜观察，发现细胞收缩成团，部浮于培养基中。（图 2-3）

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本文编号：2723413