支原体在女性下生殖道中的分子流行病学研究

发布时间：2020-06-27 04:43

【摘要】： 研究目的和意义:支原体是迄今所知能够自我复制并独立存活的最小原核细胞型微生物,种类繁多。支原体广泛存在于人类、动物、植物。目前研究发现,女性生殖道中的支原体分离率非常高,研究者陆续在女性泌尿生殖道分离出解脲支原体(Uu)、人型支原体(Mh)、生殖支原体(Mg)、穿通支原体(Mpe)、发酵支原体(Mf)、梨支原体(Mpi)。这6种支原体目前被认为与许多生殖泌尿系统疾病相关联。近几年来,对支原体感染的研究越来越受到重视,国内外关于支原体有大量的文献报道。但是关于支原体致病性的流行病学调查有着不同的结论,探讨从女性下生殖道中分离出的支原体是否具有致病性、是否需要治疗具有重要的临床指导意义。有研究认为,支原体为人体条件致病菌,寄居于人体特定器官,通常只有在机体免疫力低下或者局部微环境改变的条件下才会引起疾病;有的研究则认为,只有特定的某种或某些类型的支原体对人体才有致病作用,或者是说某种支原体会导致某类疾病的发生。对于支原体的流行病学情况,目前仍是一个有待于研究解决的问题。自上世纪80年代未,分子生物学技术的应用使支原体的研究取得了很大进展,支原体的检出率、检测准确性大为提高,为临床诊断和治疗提供了有力的依据。利用rDNA序列对支原体进行分型,是此领域的重要进展,近年来已经成为国内外研究的热点。可以预见,对生殖道支原体的分子基因检测及分型,将为全面而深入地理解泌尿生殖道支原体的多样性奠定基础。本研究应用PCR-RFLP技术,建立支原体的16SrDNA克隆文库进行RFLP分析,对普通女性人群阴道分泌物中的支原体进行详细分类。研究支原体在普通女性下生殖道中的定植情况与分型。调查人群包括女性健康体检人群、孕早中期妇女以及妇科门诊患者,明确支原体在这一人群中的流行病学情况,为进一步研究支原体与女性下生殖道疾病的关系提供理论依据。研究方法和过程:收集健康体检女性、孕早中期妇女、以及普通妇科门诊患者阴道分泌物190例。研究对象选取标准:研究对象均有性生活史,在两周内未使用过任何抗生素,取样三天内没有阴道冲洗、无阴道用药及性生活,排除经期女性。研究中收集到的阴道分泌物不经传统的培养法或是免疫法进行初步筛选,而是直接用PCR法对分泌物进行支原体检测及分型,避免层层筛选造成的菌种丢失。这种应用PCR方法对阴道分泌物直接进行检测的方法,目前在国内相关临床研究中没有广泛开展,本研究尝试应用PCR-RFLP技术,建立支原体的16SrDNA克隆文库进行RFLP分析,对普通女性人群阴道分泌物中的支原体进行详细分类。检索美国GeneBank核酸数据库中已登录各种支原体科微生物16SrDNA基因序列,设计了16SrDNA引物对GPO-和MGSO,其序列为:GPO-3:5'-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3'MGSO:5'-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3'。支原体阳性样本可以扩增出约270bp的片段。电泳检验270bp有条带的样品组的扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳回收,将PCR扩增产物分别用AluⅠ和RsaⅠ两种限制性内切酶消化,根据电泳产生的条带,比对电子酶切的结果判断支原体种类。为了验证结果的正确性,比对已经鉴定的临床株电泳结果,并根据酶切带型的不同将转化子分成不同的RFLP类型,每个RFLP类型中选取一定量的克隆子进行测序。应用Bioedit软件将测序公司返回原序列进行编辑,在GenBank数据库中进行比对分析。研究对象的临床资料、阴道分泌物涂片结果及支原体检测结果录入EXCEL数据库,采用STATA8.0统计软件进行统计学分析。计数资料采用卡方检验,精确概率法等进行分析比较,运用叉生分析进行支原体与其他病原体致病关系的分析。研究结果:本研究采用PCR—RFLP方法,在190例女性阴道分泌物中检测Uu阳性39例(20.53%),Mh阳性52例(27.37%),Uu合并Mh阳性例26(13.68%),其他类型支原体未检出。研究对象的年龄在19—64岁之间,平均年龄为34.88岁,在不同年龄分组中,Uu、Mh的阳性率均没有统计学差异:在女性健康人群(包括妇科体检人群与孕早中期体检妇女)与普通妇科门诊患者中,Uu、Mh的阳性率没有统计学差异;Uu、Mh的阳性率在阴道炎、宫颈炎的发病人群中没有统计学差异:与人工流产次数,与女性不同生理期如妊娠、绝经等,均无相关性。主要结论:1.本研究样本中,女性下生殖道中的支原体检出类型主要是Uu和Mh两种。Uu和Mh阳性率在有性生活的女性中,与年龄、下生殖道炎症、不良妊娠史、人工流产史、妊娠及绝经与否没有明显的相关性。也就是说,本研究认为:支原体中的Uu和Mh在女性下生殖道中可以正常存在,与女性年龄、不同生理期、以及下生殖道疾病没有明显相关性。 2.PCR方法应用于支原体检测,特异性、敏感度高,可重复性强,检验周期短。本研究采用的PCR—RFLP方法,选用支原体通用引物GPO-3:5'-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3'MGSO:5'-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3'及限制型内切酶AluⅠ和RsaⅠ对支原体进行检测的同时,可以确定支原体的不同分型,能够方便、快捷、准确地用于临床支原体检测。尽管本研究中没有检测到除Uu、Mh之外的其他类型支原体,但是对于难以培养的支原体的检测,本方法仍然可以借鉴使用。 3.由于本研究为初步的探索性研究,在选择人群和病种方面可能存在一定的偏倚,因此该结果并不具有普遍的代表性,希望为大样本的临床联合研究提供部分数据。另外,对于Uu、Mh与女性上生殖道感染、不孕等疾病的关系,以及对妊娠结局和新生儿的影响,可以作为进一步研究的目标。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R759;R711.3
【图文】：

序列,支原体,采集样品,琼脂糖凝胶电泳

硕士学位论文序。测序工作委托上海英俊生物技公司返回原序列进行编辑，非嵌合分析SrDNA的扩增用支原体16SrDN八通用性引物扩大小与目标基因相符，具有一定的特对照无扩增。

酶切图谱,酶切图谱,插入片段

随机挑选克隆子，重新将克隆子内质粒中的插入片段扩增出来。正确长度的插入片段经限制性内切酶Alul和天‘口I分别酶切及电泳分离，忽略产生的细小杂带，记录主要的酶切带型(图2一2，图2一3)。Alul酶切电泳产生2种类型，两种类型所占比例分别为:20.53%和27.37%;七口I也产生2种类型，对应比例相同。这两种酶对本库的分辨能力相同，但是因为本研究的样本中仅检测到Uu和Mh两种支原体，Alul产生的两种酶切图谱条带应分别为80bp，147bp，42bp和86bp，190bp

【参考文献】