Smad3抑制剂对银屑病模型小鼠皮损的影响及其作用机制

发布时间：2020-07-01 23:23

【摘要】：研究背景银屑病(psoriasis)是一种常见的以红斑鳞屑为特点的慢性炎症性皮肤病,中医称为白疙、松皮癣。中医认为本病是由素体营血亏虚,化燥生风,肌肤失养而成,急性期以血热生风为主,慢性期以血虚生风为主,导致肌肤失于濡养而发病。银屑病是一种细胞免疫异常而导致的表皮角质形成细胞过度增生与炎症反应共存的慢性疾病,其病理变化以表皮角化过度及角化不全、棘层增厚、炎症细胞浸润如树突状细胞、中性粒细胞、T细胞和巨噬细胞等以及血管异常增生为特征。迄今为止,银屑病的发病机制尚不明确,仍缺乏长期根治的方法,因此其发病机制及治疗方法的探索一直是国内外研究的热点之一。 T细胞活化在银屑病发病机制中发挥着关键作用。近年来,辅助性T细胞17(Th17)介导的炎症信号通路异常激活在银屑病的发病机制中的作用引起了学术界的广泛关注,弥补了传统上认为银屑病是由Thl/Th2介导的免疫炎症性疾病的不足。在疾病状态下,转化生长因子-β1(TGF-β1)被激活后,与前炎症细胞因子白细胞介素-6(IL-6)共同调控Th17细胞的分化和功能,从而不断加剧由白细胞介素-23/辅助性T细胞17(IL-23/Th17)作用轴所介导的皮肤炎症反应。研究表明,银屑病患者的皮疹及血浆中TGF-β1、IL-6、IL-23以及IL-17的表达水平明显升高,TGF-β信号转导通路高度激活,表皮角质形成细胞持续增生。这些研究表明在银屑病发病机制中,TGF-β1、IL-6与Th17细胞可能密切相关。 TGF-β1是一种多功能的细胞因子,调节不同的生理和病理过程。TGF-β1在T细胞分化中发挥重要作用。研究表明,缺乏TGF-β1时初始CD4+T细胞不能向Thl7细胞分化。相反,在角蛋白5(K5)基因启动子驱使下,小鼠表皮角质形成细胞过度表达TGF-β1,表现出与银屑病患者具有强烈相似性的皮肤外观,从而成为目前世界公认的转基因银屑病小鼠模型之一——K5.TGFβ1转基因小鼠(角蛋白5-转化生长因子β1转基因小鼠)。这一发现表明TGF-β1在银屑病中可能具有致病作用,但是其致病的分子机制目前尚未明确。TGF-β1与受体结合后,激活下游信号分子Smad2和Smad3,从而调节其生物活性。其中Smad3被普遍认为在免疫应答及纤维化反应中发挥关键作用,而Smad2的作用与Smad3相反。根据Smad3在某些炎症性及纤维化疾病中的重要致病作用,着眼于研究Smad3可能为银屑病的治疗方法提供新思路。在本项课题中,我们假设阻断TGF-β/Smad信号的过度激活,抑制TGF-β与IL-6共同调控的Th17信号通路,从而对银屑病模型小鼠发挥治疗作用。由于Smad3在决定转化生长因子β发挥生物学效应起关键作用,本研究使用一种Smad3的特异性抑制剂——Smad3抑制剂来观察对TGF-β1转基因小鼠银屑病皮疹的治疗作用。Smad3抑制剂已被证实能特异性抑制Smad3磷酸化。转化生长因子p (transforming growth factor, TGFβ):TGFβ是一类多功能的细胞因子,由多种组织细胞合成,调控着细胞周期,影响细胞的增殖、分化、黏附、转移和凋亡,与人类多种疾病密切相关。TGFβ通过TGFβ/Smad信号通路发挥生物学效应。TGF-β1促进成纤维细胞的生长,并在T细胞分化中发挥重要作用。 Smad3:Smad3是Smads蛋白家族成员之一。Smads家族蛋白是一类新发现的TGF-β信号的细胞质内介导者,在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用。TGF-β作为配体形成的受体复合物,激活Smads进入核内,共同激活或抑制它们调节的靶基因的转录。Smad3已被证实在炎症和纤维化反应中发挥关键作用。白细胞介素-17(白介素-17,Interleukin-17, IL-17):白细胞介素-17是一个重要的促炎症细胞因子,由辅助性T细胞(Th17)及先天性免疫细胞等分泌,在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用。研究发现IL-17在多种自身免疫疾病如多发性硬化,类风湿性关节炎,银屑病患者的特定病理组织中,其表达显著上调。白细胞介素-6(白介素-6,Interleukin-6, IL-6):IL-6是一种促炎和多效性的细胞因子,可调节多种细胞的生长与分化,具有调节免疫应答、急性期反应及造血功能,并在机体的抗感染免疫反应中起重要作用。由角质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞和肿瘤细胞产生,参与真皮和表皮细胞的生长和分化。白细胞介素-23(白介素-23,Interleukin-23, IL-23):IL-23可作用于活化T细胞、记忆性T细胞和树突状细胞,在炎症性疾病、自身免疫性疾病的发病以及抗肿瘤和抗感染等方面发挥重要作用。IL-23刺激Th17的扩增和维持,研究发现银屑病患者在皮肤损害处IL-23p19和p40mRNA的水平显著增高。研究目的和意义本项研究旨在通过观察Smad3抑制剂对银屑病模型小鼠皮肤组织中各纤维化和炎症细胞因子的蛋白和mRNA表达水平的影响,分析Smad3抑制剂对银屑病转基因小鼠中TGF-β/Smad所调控的皮肤纤维化的作用及分子机制以及Th17所介导的皮肤炎症的作用及分子机制。研究Smad3抑制剂对转基因小鼠银屑病皮损的治疗作用,旨在从分子水平上阐述Smad3在银屑病中潜在的致病作用,为银屑病的发病机制、治疗方法提供新思路和理论支持,并为研究目前已被证实具有Smad3抑制剂相同作用的中药对银屑病的治疗作用及分子机制奠定坚实的基础和科学依据,降低单纯运用西药治疗银屑病所引起的不良反应,从分子水平上探索中西医结合治疗银屑病的新方法,更好地指导临床和科研。研究方法 1.K5-TGFβ1转基因小鼠(角蛋白5-转化生长因子β1转基因小鼠)及正常小鼠,适应性饲养12周后用于本项研究。TGFβ1野生型(TGFβ1WT)小鼠不表现疾病状态,为正常小鼠对照。同窝TGFβ1转基因小鼠随机分配到疾病对照组、空白对照组及Smad3抑制剂治疗组,同窝TGFβ1野生型小鼠作为正常小鼠对照,每组各6只。 2.Smad3抑制剂溶解于DMSO,并制作成药膏。疾病对照组及正常小鼠对照组不作干预,空白对照组使用不含Smad3抑制剂的药膏,治疗组使用含有Smad3抑制剂(5ug/ml)的药膏。药膏用于转基因小鼠的皮疹,每日2次,连续使用2个月。 3.在治疗前及治疗期间每隔2周使用国际上针对银屑病转基因小鼠疾病严重程度所建立的评分系统对转基因小鼠的皮损进行评分,同时用标尺测量转基因小鼠及正常小鼠皮肤厚度的变化。 4.药膏使用2个月后,收集各组小鼠的血浆及皮肤组织,常规处理后,进行石蜡包埋、切片以及提取皮肤组织蛋白及RNA,以供后续实验分析。 5.应用苏木素及伊红染色(HE)评估小鼠皮肤的组织学改变。 6.马松三色染色评估小鼠皮肤胶原纤维沉积的变化。 7.免疫组织化学技术(IHC)及蛋白质免疫印记法(western blot)检测小鼠皮肤组织中各细胞因子的蛋白表达水平。 8.免疫荧光染色技术检测免疫细胞的数量。 9.逆转录(RT)聚合酶链反应(real-time PCR)检测小鼠皮肤组织中目的基因的mRNA表达水平。 10.酶联免疫吸附试验(Elisa)检测小鼠血浆中各细胞因子的蛋白表达水平。 11.实验数据采用GraphPad Prism5.0统计软件包进行分析。本项研究的实验数据以均数±标准差表示,均数间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA/NK法),P0.05为差异有统计学意义。研究过程及结果 1.为确定Smad3抑制剂安全有效的剂量用于本项研究,设计3个含有不同浓度Smad3抑制剂(低剂量、中剂量及高剂量)的药膏——分别为2.5,5,10μg/ml(重量／体积),与不含Smad3抑制剂的空白对照药膏分别应用于TGFβ1转基因小鼠(每组3只)的皮肤病灶3个月,每日2次。根据组织学改变、胶原纤维沉积程度、小鼠疾病严重程度评分、小鼠皮肤厚度以及真皮组织中CD3阳性T细胞及F4/80阳性巨噬细胞的数量,提示5μg/ml的Smad3抑制剂药膏对银屑病转基因小鼠具有最佳治疗作用。这种作用体现在治疗1个月后皮肤病灶明显改善并在3个月的治疗时期内持续抑制疾病进展。3个剂量的Smad3抑制剂药膏同时应用于正常小鼠,其余处理因素相同,其组织学特点、炎症因子、胶原纤维沉积以及血清乳酸脱氢酶水平均表明最高剂量的Smad3抑制剂(10μg/ml)没有毒性。因此,本项研究中5μg/ml的Smad3抑制剂安全有效,应用于每组6只的TGFβ1转基因小鼠,每日2次,连续治疗2个月(平均有效时间)。与同年龄正常小鼠相比,疾病对照组及空白对照组的转基因小鼠皮肤演变为典型的银屑病样皮损,即红斑、增厚的皮肤上覆盖银白色鳞屑。Smad3抑制剂治疗的TGFβ1转基因小鼠,其疾病严重程度评分(F=4.413,P0.05),表皮厚度(F=24.57,P0.01),皮肤双褶厚度变化(F=8.423,P0.05)表皮与真皮中浸润的CD3阳性T细胞(F=19.18,P0.05)及F4/80阳性巨噬细胞(F=22.35,P0.01)；马松三色染色法(F=16.01,P0.01)及α-平滑肌肌动蛋白的免疫组织化学检测(F=32.23,P0.01)胶原纤维沉积与空白对照组间差异均有统计学意义,提示Smad3抑制剂可有效减轻银屑病转基因小鼠的炎症反应及胶原沉积。疾病对照组与空白对照组比较,上述指标无统计学意义。 2.进一步检测Smad3抑制剂减缓TGFβ1转基因小鼠疾病进展所潜在的分子生物学机制。首先Smad3抑制剂是否通过阻断TGF-β/Smad3信号从而对TGFβ1转基因小鼠银屑病样皮损起治疗作用。Smad3抑制剂治疗的TGFβ1转基因小鼠皮肤组织中TGFβ1的蛋白(F=36.74, P0.01)、mRNA (F=8.891, P0.05)表达水平及血浆中TGFβ1的蛋白(F=34.07,P0.05)表达水平与空白对照组间差异有统计学意义；免疫组织化学技术(F=21.88,P0.05)及免疫印记法(F=15.05,P0.05)检测TGFβ下游的信号分子蛋白Smad3磷酸化水平与空白对照组间差异有统计学意义,提示Smad3抑制剂通过抑制TGF-β/Smad3信号通路对银屑病起治疗作用。疾病对照组与空白对照组比较,上述指标无统计学意义。 3.进一步检测在阻断TGFβ/Smad3的同时,Smad3抑制剂是否阻断Th17炎症信号通路,从而抑制TGFβ1转基因小鼠的疾病进展。Smad3抑制剂治疗的TGFβ1转基因小鼠皮肤组织中IL-6(F=6.397, P0.05). IL-23(F=4.921, P 0.05、IL-17A(F=7.583,P0.05)的mRNA表达水平及血浆中IL-6(F=5.119, P0.05)、IL-23(F=5.402, P0.05)、IL-17A (F=7.046, P0.05)的蛋白表达水平与空白对照组间差异有统计学意义。TGFβ1转基因小鼠皮肤病灶中CD4+IL-17A+Th17细胞,即CD4与IL-17A双阳性的Th17细胞经Smad3抑制剂治疗后其数量明显减少(F=5.644,P0.05),与空白对照组间差异有统计学意义。Th17的转录因子——维A酸相关孤独受体yt (RORyt)在Smad3抑制剂治疗后其表达水平((F=5.154,P0.05)明显下降,与空白对照组间差异有统计学意义。上述结果提示Smad3抑制剂对IL-23/Th17作用轴具有抑制作用,从而减轻TGFβ1转基因小鼠的炎症反应。疾病对照组与空白对照组比较,上述指标无统计学意义。讨论本项研究为Smad3抑制剂作为银屑病一种新型的具有治疗潜力的治剂提供理论依据。Smad3抑制剂可以有效降低银屑病皮肤组织胶原纤维沉积及TGFβ1的过度表达,抑制Smad3磷酸化水平的上调,有效改善体内IL-6、IL-17A、 IL-23细胞因子含量,减少Th17细胞的过度分化,降低炎症反应,从而对银屑病起治疗作用。研究结果表明TGFβ/Smad3信号通路可能是对银屑病进行有效治疗的新靶向,具有创新性。此外,本研究还发现抑制TGFβ/Smad3信号通路及IL-23/Th17炎症信号通路是Smad3抑制剂有效阻断K5.TGFβ1转基因小鼠银屑病样皮损进展的分子机制。着眼于TGFβ/Smad3信号通路及IL-23/Th17炎症信号通路将为银屑病的发病机制及治疗方法提供新思路。科研工作来源本项研究来源于自选课题,为南方医科大学及香港中文大学合作项目,于香港中文大学李嘉诚健康科学研究所进行科学研究,课题基金来源于香港研究资助局(RGC),基金编号：RGC GRF469110,及CUHK3/CRF/12R。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R758.63

【参考文献】