SPRY1对银屑病皮肤固有免疫的影响及机制研究

发布时间：2020-07-04 05:33

【摘要】：[背景]银屑病是一种多基因共同参与的复杂疾病,在多种诱发因素如外伤、感染或药物等刺激下,于易感个体中出现银屑病表型。特征性的皮损表现为境界清楚、覆有白色鳞屑的红斑、斑块,病理表现为表皮角化过度、角化不全、棘层肥厚、真皮血管扩张和淋巴细胞为主的炎性浸润。银屑病患者常伴有系统性疾病如高血压、糖尿病、冠心病、肥胖及代谢综合征等,且银屑病病程漫长、反复发作,是严重影响患者身心健康和生活质量的复杂皮肤疾病。因此对银屑病发病机制的研究十分重要且刻不容缓。免疫发病机制在银屑病发病中占有重要地位,也是近年来指导银屑病治疗的重要基础,其中以IL-23/T17轴为中心的固有免疫到适应性免疫炎症信号环路是研究的主要方向,与其相关的蛋白分子一直受到关注。SPRY1蛋白属于SPRY蛋白家族,是一种富含半胱氨酸的蛋白,具有多个结构功能域,包括C-端富含半胱氨酸的功能域,Raf1结合功能域以及一个高度保守的N-端功能域。既往的研究明确了SPRY1对RTK信号通路负反馈调节作用,并参与到多种疾病及生理过程中。我们前期的研究结果发现SPRY1过表达对角质形成细胞具有抑制增殖、促进凋亡及影响分化的作用,并且在银屑病患者及正常人间存在差异表达,但SPRY1在银屑病发病机制中的具体作用如何,是否参与了银屑病固有免疫发病机制以及其可能的作用,都尚未有深入的研究。因此,在本论文中我们将深入探讨SPRY1对银屑病发病机制尤其是固有免疫的影响及机制研究。[目的]明确SPRY1在银屑病及正常人皮肤、角质形成细胞中的表达差异;明确SPRY1与皮肤屏障功能、固有免疫相关基因、银屑病相关炎症因子以及角质形成细胞生物学功能之间的相关性;通过K14-SPRY1小鼠模型的研究,阐明SPRY1在皮肤屏障、抗菌肽改变及固有免疫中的功能;通过K14-SPRY1条件性过表达小鼠,发现创伤、感染等诱发银屑病表型产生的新机制,并以此为基础进一步发现银屑病治疗的新靶标。[方法]以免疫组化及免疫荧光明确SPRY1在正常人皮肤及角质形成细胞中的定位及表达;分离培养正常人角质形成细胞,WB及qRT-PCR法检测SPRY1与细胞分化相关性;免疫组化及免疫荧光检测银屑病、湿疹、结节性痒疹患者皮损中SPRY1的表达及定位,RNAseq、qTR-PCR、WB法明确SPRY1在银屑病患者皮损区角质形成细胞与正常人角质形成细胞中的表达差异;将LPS、Poly I:C、双氧水及炎症因子(IL-6、IL-17A、IL-23、TNFα)及银屑病治疗药物(氯倍他索、MTX、卡泊三醇、阿维A)与体外培养的正常人及银屑病患者皮损区角质形成细胞共孵育,以WB及qRT-PCR法比较以上处理因素对SPRY1在相应角质形成细胞中表达的影响;以免疫荧光检测S P RY1与抗菌肽L L 3 7在正常人及银屑病患者组织及银屑病患者邻近皮损区角质形成细胞中的表达与定位;重组人LL37处理正常人角质形成细胞,以WB及qRT-PCR法检测处理后SPRY1表达的改变;以免疫共沉淀及质谱分析检测SPRY1可能相互作用的蛋白;以WB及qRT-PCR法检测SPRY 1转基因小鼠与WT小鼠表皮中表皮屏障、分化、增殖、凋亡等相关蛋白和基因的表达差异;构建小鼠创伤模型,通过Masson三色染色、免疫组化及WB比较SPRY1转基因小鼠与WT小鼠创伤愈合过程中的差异;以IMQ构建小鼠银屑病模型,通过皮损区HE染色比较表皮厚度、真皮血管数量,免疫荧光及qRT-PCR比较造模后SPRY1的表达差异,qRT-PCR及ELISA方法比较炎症因子、表皮屏障、固有免疫等相关基因及蛋白的改变;以流式细胞技术检测造模后真皮、皮肤引流淋巴结及外周血中炎症细胞的改变。[结果]1、SPRY1连续表达于人皮肤颗粒层,参与角质形成细胞晚期分化;2、在银屑病患者皮损区SPRY1表达减少或缺失,药物治疗后的皮损区SPRY1表达恢复;3、LPS、Poly I:C、H2O2及银屑病相关炎症因子抑制正常人角质形成细胞SPRY1的表达;氯倍他索、MTX、卡泊三醇及阿维A可促进银屑病皮损区角质形成细胞SPRY1的表达;4、抗菌肽LL37抑制正常人角质形成细胞中SPRY1表达;5、过表达SPRY1可促进C57BL/6小鼠皮肤中表皮角质形成细胞凋亡、抑制表皮增殖,影响表皮分化。6、表皮特异性地过表达SPRY1延迟C57BL/6小鼠皮肤创伤愈合,影响创缘肉芽组织成熟机化,抑制增生表皮的爬行;7、过表达SPRY1减轻IMQ诱导的C57BL/6小鼠银屑病样皮炎表型,影响表皮屏障、固有免疫相关基因的表达,此外还抑制了小鼠真皮中IL-17A+γδT细胞增加及moDCs的聚集。[结论]SPRY1在银屑病患者皮损区组织中及分离培养的角质形成细胞中表达减少或缺失;SPRY1抑制角质形成细胞增殖、促进凋亡、影响晚期分化;正常人角质形成细胞受感染、损伤或炎症因子刺激后SPYR1表达降低;银屑病皮损区皮肤及角质形成细胞经药物治疗后SPRY1随皮损改善而表达恢复;表皮特异性过表达SPRY1影响小鼠皮肤创伤的愈合;表皮特异性过表达SPRY1减轻IMQ诱导的小鼠银屑病样皮炎。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R758.63
【图文】：

皮炎,银屑病,特性

能发挥相互补偿的作用。ＳＰＲＹ１蛋白具有多个结构功能域，包括Ｃ－端富含半胱氨逡逑酸的功能域，Ｒａｆｌ结合功能域，一个高度保守的Ｎ－端功能域Ｍｌ。ＳＰＲＹ逡逑是受体酪氨酸激酶（ＲＴＫ）的负反馈抑制剂（图１．４），ＳＰＲＹ１可负性调控生长因子诱逡逑导的细胞增殖、迁移和分化［２ａ２１］，通过激活ＮＦｋＢ信号途径诱导衰老相关表型［２１］，逡逑而ＮＦｋＢ信号途径许多相关基因均与固有免疫有关［２２１。逡逑有研究发现Ｓｐｒｏｕｔｙ邋１是唯一的可由激活的小鼠ＣＤ４＋Ｔ细胞受体诱导的Ｓｐｒｏｕｔｙ逡逑亚型，并且与ＴＣＲ信号通路共刺激相关的Ｓｐｒｏｕｔｙｌ表达依赖于细胞分化的状态［２３】。逡逑与之相比，在小鼠脾脏中的Ｂ细胞，则为ｓｐｒｏｕｔｙ２而非ｓｐｒｏｕｔｙｌ与其ＢＣＲ相互作用，逡逑以负反馈调节的方式抑制ＥＲＫ通路激活，进而表明其参与Ｂ细胞的成熟分化［２４］。在逡逑类风湿性关节炎的滑膜细胞及组织中存在ｍｉＲ－３３８－５ｐ高表达，当成纤维样滑膜细胞逡逑中高表达ｍｉＲ－３３８－５ｐ后，可直接沉默Ｓｐｒｏｕｔｙｌ的ｍＲＮＡ３’ＵＴＲ，下调Ｓｐｒｏｕｔｙｌ蛋白逡逑４逡逑

作用位点,信号通路,蛋白

邋Ｉ：－逡逑Ｍｅｔｔｅ邋Ｄ．Ｈａｚｅｎｂｅｒｇ．邋Ｂｌｏｏｄ．邋２０１４．邋１２４：邋７００－７０９逡逑图１．３人ＩＬＣｓ参与正常、特性应皮炎及银屑病的不同分类。逡逑Ｓｐｒｏｕｔｙ（ＳＰＲＹ）蛋白是１９９８年发现的Ｒａｓ／ＭＡＰ激酶信号链特异性抑制蛋逡逑白［１７］，随后在哺乳动物中也发现其类似物，分别命名为ＳＰＲＹ１－４［１８ＬＳＰＲＹ１蛋白是逡逑一种富含半胱氨酸的蛋白质，在血管新生中发挥重要的作用。人类ＳＰＲＹ蛋白各个逡逑组分的表达在不同的人体组织中有所不同。ＳＰＲＹ１，２和４在胚胎各期及成人组逡逑织中广泛表达，而ＳＰＲＹ３仅表达于成人的脑和睾丸组织。各个ＳＰＲＹ俎分之间并不逡逑能发挥相互补偿的作用。ＳＰＲＹ１蛋白具有多个结构功能域，包括Ｃ－端富含半胱氨逡逑酸的功能域，Ｒａｆｌ结合功能域，一个高度保守的Ｎ－端功能域Ｍｌ。ＳＰＲＹ逡逑是受体酪氨酸激酶（ＲＴＫ）的负反馈抑制剂（图１．４），ＳＰＲＹ１可负性调控生长因子诱逡逑导的细胞增殖、迁移和分化［２ａ２１］

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