雷帕霉素对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬诱导效应及其分子机制的初步研究

发布时间：2020-07-04 18:11

【摘要】：目的:初步探讨雷帕霉素在不同浓度和不同孵育时间下,对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的诱导效应及其分子机制。方法:不同浓度雷帕霉素处理HaCaT细胞4 h或12 h后,利用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测雷帕霉素对细胞活力的影响,并提取蛋白进行蛋白印迹实验,检测LC3-Ⅱ表达水平,作为自噬的检测方法;通过透射电镜分析自噬体形成,确认雷帕霉素对自噬的诱导效果。检测自噬调控上游关键元件哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达及其se~(2481)和ser~(2448)磷酸化产物水平,分析mTOR活性;并分析自噬调控下游的另一关键基因Atg7的表达,初步分析雷帕霉素诱导HaCaT细胞的分子机制。结果:不同浓度雷帕霉素处理4 h,对HaCaT细胞的活力没有显著的影响。高剂量雷帕霉素(80 nmol/L和100 nmol/L)在处理12 h后对HaCaT细胞的活力产生毒性效应。20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h诱导HaCaT细胞LC3-Ⅱ表达上调,而20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育12 h仍具有诱导效应。相较于其他浓度,在50 nmol/L雷帕霉素孵育诱导的LC3-Ⅱ表达上调效应最为显著,并且在药物孵育4h时超微结构水平诱导产生胞质内大量自噬体形成。1~50nmol/L浓度的雷帕霉素孵育4 h或12 h均可诱导HaCaT细胞mTOR ser~(2481)和mTOR ser~(2448)磷酸化产物水平降低:然而Atg7表达不能观测到显著的差异。结论:50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h具有显著的诱导HaCaT细胞自噬效应。HaCaT细胞mTOR分子对雷帕霉素处理敏感,可被其诱导产生蛋白活化抑制效应。这种mTOR信号抑制可能参与了雷帕霉素对HaCaT细胞的自噬诱导效应,但Atg7没有参与这种调控效应。
【图文】：

70 临床皮肤科杂志2014年43卷第5期JClinDermatol,May2014,Vol.43,No.5：二…7-i—-i289 —mTOR S+p2448) i289?_mTOR mKm-?:SB78Atg-7 fSm f16 LC3-I ffi,二Q\0？14 —?—| m451 ra,"n 理HP?>_、取1：空白对照,2:DMSO，3:lnmol/L雷帕霉素， A、B:细胞全景图(xl500)，C、D:左侧细胞的4:5nmol/L雷帕霉素,5：10nmol/L雷帕霉素， 局部放大图，部分囊泡内可见皱缩损伤的线6：20nmol/L雷帕霉素,7：50nmol/L雷帕霉素 粒体结构(x6000)图1雷帕霉素孵育HaCaT细胞4h的 图350nmol/L雷帕霉素处理HaCaT蛋白表达和磷酸化分析 细胞4h后自噬体形成电镜图像等[15]的研究表明，雷帕霉素可以诱导WRN缺陷的人ku1234567 成纤维细胞自噬，并且可以减低DNA损伤聚集和促2891?一nS^mT0R 进细胞生长。此外,Xiao等M利用深二度烧伤模型大鼠==^,mR 研究发现，雷帕霉素可以通过诱导自噬延缓组织损伤289L__ 1^24487 及促进表皮再生修复。因此,雷帕霉素在皮肤的病理289| |mT0R 学和生理学中的研究价值值得关注。]—=====^ 随着在生命科学领域中自噬研究的不断深入，作78Atg-7 为人类最大器官的重要构成——角质形成细胞自噬的 生物学意义得到了很多学者的关注。例如，自噬参与角15 质形成细胞分化ii7],某些药物或生物学活性物质可以‘ 诱导角质形成细胞自噬…、然而，雷帕霉素对角质形45p_actin 成细胞自噬的诱导效应及其分子机制目前仍然缺乏研,‘,j+|)g,丨、阶),~ ：.,^ 究资料。0此,我们设计并实施了本项研究。使用不同1:空白对照，2:DMSO，3:1nmol/L雷帕霉素， 、Nr^N:^山二系丰.^ A?,

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