人毛乳头细胞永生化的实验研究

发布时间：2020-07-05 07:19

【摘要】： 背景: 毛乳头细胞(dermal papilla cells, DPC)在毛囊形态发生、生长周期调控及维持毛发生长发育中起重要作用,并具有在体内外条件下重建毛囊的功能。DPC功能的异常变化是导致毛囊周期失衡和脱发现象的主要起始因素。对DPC生物学功能变化的调控机制进行深入研究对毛囊生物学和毛发疾病的研究都有重大的意义。随着生物工程技术的发展,组织工程皮肤的研究和应用得到长足进展,目前已有多种商品化产品出售并用于临床。但目前以成纤维细胞和角质形成细胞为种子细胞构建的组织工程皮肤没有毛囊等皮肤附属器官,在组织结构和功能上与正常皮肤组织仍有较大差异。利用DPC诱导毛囊形成的特性,将其作为种子细胞在组织工程皮肤上重建毛囊,形成含有毛囊结构的人工皮肤替代物,将极大提高创伤愈合的质量。但DPC标本不易获得,其在通常的体外培养条件下经过十几次的传代后会停止增殖,出现衰老和死亡,且随着体外培养传代次数增多会逐渐失去其固有的一些生物学特性和功能,极大地限制了其研究和应用。建立永生化细胞系是解决体外培养条件下细胞衰老的一种常用手段。然而,以往建立细胞系的方法大多是通过转染病毒基因或癌基因诱导细胞永生化,通过这些方法建立的细胞系有许多局限性:其基因整合是随机性的,转染获得的是转化细胞而非正常细胞,其表型、核型等可发生改变。且有的转化细胞系仅通过了M1期,寿命延长,而并非永生化。研究表明,端粒酶的激活可以延缓细胞衰老,甚至使细胞永生化。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)作为端粒酶的催化亚单位和限速酶,在端粒酶活性维持中起关键作用。将外源性hTERT基因转入目的细胞,可诱导细胞端粒酶活性,使细胞永生化。hTERT介导的永生化细胞系保留了更多正常细胞的生物学特征。另外,hTERT介导的永生化细胞系已逾越M2期,同胚胎干细胞一样,是真正意义上的永生化。为此,本研究将外源性hTERT基因导入体外培养的正常人DPC,拟建立永生化人DPC系,并进一步分析该细胞系的生物学和功能学特征,以期为DPC的基础研究和临床应用提供充足的、稳定的和正常的细胞来源。目的: 1.建立永生化人DPC系。 2.观察体外培养条件下该细胞系的生物学和功能学特征。 3.观察该细胞系在体内诱导毛囊形成的能力。方法: 1.采用我科建立的“酶消化法”分离培养正常人DPC,观察体外培养DPC形态和生长情况并行α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫组化染色鉴定。 2.采用脂质体转染法,将空载体质粒pIRES2-EGFP和含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT分别导入体外培养的第3代正常人DPC,经G418筛选得到阳性克隆,连续传代培养。分别采用PCR和RT-PCR法检测转染细胞内hTERT基因的整合与表达,采用端粒酶重复序列扩增(TRAP)-ELISA法检测转染细胞的端粒酶活性。 3.取转染pIRES2-EGFP-hTERT第30代DPC,在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况,采用免疫组化检测α-SMA在细胞内的表达,采用细胞生长曲线分析和细胞周期测定观察细胞的增殖特征,采用染色体核型分析、软琼脂克隆形成实验和裸鼠致瘤实验观察细胞的转化特征,采用ELISA法检测培养上清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)浓度观察细胞的分泌功能。 4.将转染pIRES2-EGFP-hTERT第30代DPC与刚分离的毛囊上皮细胞混合后直接注射到裸鼠背部皮下观察其在体内诱导毛囊形成的能力。结果: 1.采用我科建立的“酶消化法”分离培养了正常人DPC,体外培养的DPC形态上类似成纤维细胞,单个细胞的形态呈梭形,体积较大,具有明显的多层凝集性生长特性,表达体外培养DPC的特异性标记物α-SMA。 2.利用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将空载体质粒pIRES2-EGFP和含有hTERT基因的质粒pIRES2-EGFP-hTERT分别导入体外培养的正常人DPC,经G418筛选3周后转染空载体质粒pIRES2-EGFP组和质粒pIRES2-EGFP-hTERT组各出现1个阳性细胞克隆,分别命名为DPC-EGFP和DPC-hTERT。滤纸片法将细胞克隆移至24孔板扩大培养后DPC-EGFP细胞生长增殖能力较差,传至12代后细胞发生衰老、死亡。而DPC-hTERT细胞扩大培养后生长良好,增殖能力强,现已连续传至65代,传代中细胞生长增殖速度无明显变化。检测发现DPC和DPC-EGFP细胞无hTERT基因的整合与表达,端粒酶活性为阴性;而DPC-hTERT细胞稳定整合与表达hTERT,同时端粒酶活性转为阳性。 3. DPC-hTERT形态和生长特性与低代DPC基本相同,α-SMA免疫组化染色阳性,生长增殖活跃,无明显转化特征,染色体核型正常,在软琼脂内不能生长,无裸鼠致瘤性,具有正常DPC的分泌功能。 4. DPC-hTERT与刚分离的毛囊上皮细胞混合后注射到裸鼠背部皮下能诱导内含较多细胞和色素颗粒的表皮囊肿结构形成。结论: 1.我们利用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将外源性hTERT基因导入体外培养的正常人DPC,成功地建立了永生化人DPC系DPC-hTERT。 2. DPC-hTERT基本上是正常细胞而无明显转化特征,保持了正常人DPC的生物学和功能学特征。可望为深入研究DPC生物学功能变化的调控机制提供理想的细胞模型,为构建含有毛囊等附件的全功能组织工程皮肤提供充足的种子细胞。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R751
【图文】：

质粒,测序

图 1-2 质粒 pIRES2-EGFP-hTERT 测序结果 (第一部分)CAAAAGAGTGGTTAGTGAACGTCAGAGCATAACGTGCTACCGGGATAAGCTAGCTAAGCTTCGAATTACCACCATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGAGCCGCTCCCTGCTGCGCAGCCACTACCGCGAGGTGCTGCCGCTGGCCACGTTCGGCGCCTGGGGCCCCAGGGCTGGCGGCTGGTGCAGCGCGGGGACCCGGCTTCCGCGCGCTGGTGGCCCAGTGCCTGGTGTGCGTGCCCTGGGACGCACGCCCCCCGCCGCCCCCTCCTTCCGCCAGGTGTCCTGCCTGAAGGAGCTGGTCGAGTGCTGCAGAGGCTGTGCGAGCGCGGCGCGAAGAACGTGCTGGCCTCTTCGCGCTGCTGGACGGGGCCCGCGGGGGCCCCCCCGAGGCCTTCACCACGTGCGCAGCTACCTGCCCAACACGGTGACCGACGCACTGCGGGGGAGCCGTGGGGGCTGCTGCTGCGCCGCGTGGGCGACGACGTGCTGGTTCACCTGCACGCTGCGCGCTCTTTGTGCTGGTGGCTCCCAGCTGCGCCTACCAGGTGT

毛乳头,细胞

细胞生长较快，向四周呈放射状生长(图 1-4)，此时毛乳头逐渐失的形状，形成成片的细胞生长致密区。培养的 DPC 在散开 10 d ~ 14 d 后又融合，融合后细胞大致仍由呈放射状排列的多个细胞团组成，中央区细胞出并向上堆积，呈凝集性生长。凝集性生长初期的 DPC 多呈多角形或长三角是凝集团中央区的细胞，周边区细胞则多呈梭形，形态类似成纤维细胞，但较大。经胰酶消化并传代的 DPC，可在 2 h 内贴壁并铺开生长。细胞排列方式开则，随着细胞数目增多，DPC 逐渐重新倾向凝集性生长(图 1-5)。随着时间凝集性生长现象逐渐明显，如果不给予传代干预，则向上堆积成细胞球。培一般 7 d 后开始逐渐融合，凝集成团的 DPC 可以形成类似最初分离出的而，随着 DPC 传代次数增加，凝集性生长现象逐渐消失，7 代以后的 D再出现凝集性生长现象(图 1-6)。

【参考文献】