复发性尖锐湿疣HPV6 L1基因原核表达质粒构建及序列分析

发布时间：2020-07-10 20:49

【摘要】：目的 构建广州地区尖锐湿疣复发患者病变组织分离的乳头瘤病毒晚期基因—L1原核表达质粒,为后续L1蛋白表达及研究复发患者感染乳头瘤病毒L1蛋白生物学特性提供依据;复发患者感染乳头瘤病毒晚期基因测序,与原始序列比对,分析其序列变片情况。 方法 扩增复发尖锐湿疣患者病变组织中乳头瘤病毒早期基因E6、E7之间一段保守序列,经Rsa Ⅰ内切酶酶切分型鉴定,选取一例感染HPV6型患者皮损,采用PCR技术扩增乳头瘤病毒晚期基因—L1,经酶切、纯化后与经过相同酶切的原核表达载体pQE40质粒连接,热冲击入感受态大肠杆菌DH5α,经扩增后酶切鉴定,阳性克隆进行测序,获得基因组晚期区L1序列。 结果 四例复发患者感染HPV酶切分型结果显示,有三例临床标本感染HPV6型,一例感染HPV11型。这提示复发患者仍然以6/11感染为主。选取的HPV6型L1基因测序,发现其组织来源与HPV6b型更相近。与GenBank收录的原型相比,L1基因有7处碱基发生突变,推导其编码的氨基酸序列有3处发生变化。原始序列6062处的A突变为G,其编码的氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸:6684处的核苷酸A突变为T,其编码的氨基酸由谷氨酸变为缬氨酸;6945处的核苷酸T突变为C,其编码的氨基酸由异亮氨酸变为苏氨酸;其余四处为:6598处的A→T,7081处的A→G,7099处的G→A,7243处的C→A,均为同义突变。 结论 成功构建了pQE40 HPV6b L1重组质粒;复发尖锐湿疣患者病变处HPV6 L1基因结构有一定变异,下游序列变异程度更大。序列变异主要集中和接近在Wanderly的K3和林少洪的SR4区间即:6945位点、7081位点、7099位点和7243位点。这提示上二述区间可能是更易发生突变的区域,这些改变与病毒致病性可能存在一定关系。R1和R2易突变区间虽然较短,仅100bp左右,但本研究发现集中在此区间的突变都出现了编码氨基酸的改变,其可能存在更加重要的生物学意义。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R752.53
【图文】：

暨南大学硕士学位论文复发性尖锐湿优HPv6LI基因原核表达质粒构建及序列分实验结果HPv型鉴别结果四例临床标本采用分型引物，均扩增出了目的基因，产物为HVP基因E6、E7之间的保守序列，长度为233bp(见图)l，文献报道此序列比较保守易发生突变，是理想的型别鉴别区域，模拟图可以看出此序列经Rasl酶切PV6型可得到144bp和96bp大小的片断，HPVll可得到16lbp和74bp大小的(见图2)。

我们对上述扩增的CPR产物经过纯化后，应用RSal内切酶酶切后，电泳发现有三例得到144bp和96bp大小片断，鉴定为HVP6型;有一例得到16blp和74bp大小的片断，鉴定为HVPn型(见图3)。图3M:100bPE6、E7之问保守序列酶切后2%琼脂糖凝胶电泳Marker;l为HPV6型酶切结果;2为HVPll酶切结果二、HPVLl扩增结果Ll基因是乳头瘤病毒主要晚期基因，长度约为1500Pb，是HPv分型的主要依据，也是本实验的目的基因。一般来讲在PRC过程中，经过30个循环，每400一4000bp的序列就会出现一个碱基的误配〔77]，这种由于Tqa酶误配而致扩增序列发生碱基替换是影响序列分析和分型的主要原因，本实验目的基因是1500Pb

HPv6型的DNA标本为模板，进行PRC扩增，然后在0.8%的琼脂糖凝胶中电泳。结果示，在1500饰处有明亮的DNA条带。未见杂带。初步提示扩增L1基因成功(见图4)。

【参考文献】

相关期刊论文 前6条

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本文编号：2749431