shRNA沉默livin基因对人恶性黑素瘤A375细胞周期和凋亡的影响

发布时间：2020-07-12 12:03

【摘要】： 目的:肿瘤的发生不仅与细胞的异常增殖和分化有关,也与细胞凋亡的异常有关。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosi s protein,IAP)是一类内源性细胞抑制因子,其过度表达引起凋亡不足与肿瘤发生密切相关。因此以IAP为靶点,寻找治疗恶性肿瘤的新途径,成为当今肿瘤基因治疗的研究热点。Livin是IAP家族成员之一,Vucic等因该基因在人黑色素瘤细胞中高表达,又称之为ML-IAP(melanomaIAP),特异的分布于多种肿瘤组织,与肿瘤的发生、发展、预后及耐药相关,将可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。本实验拟构建针对人livin基因的小干扰RNA表达载体,观察对人恶性黑素瘤A375细胞凋亡和周期的影响,为探索恶性黑素瘤的基因治疗提供实验依据。方法:研究对象为人恶性黑素瘤A375细胞株。采用:(1)基因克隆技术构建pGPU6-GFP-livin-shRNA表达载体。(2)通过培养A375细胞、细胞转染,利用荧光显微镜观察pGPU6-GFP-livin-shRNA在细胞内的表达。(3)分别获取子组(空白组、脂质体组、阴性对照组、实验组1、实验组2)总RNA,采用荧光定量PCR技术检测转染前后livin mRNA的表达变化情况。(4)通过细胞转染,用流式细胞术(FCM)检测A375细胞的凋亡情况。(5)PI单染流式细胞术检测细胞周期情况。结果:(1)采用基因克隆技术成功构建pGPU6-GFP-livin-shRNA表达载体,并通过脂质体介导转染人恶性黑素瘤A375细胞株,在荧光显微镜下观察到绿色荧光。(2)荧光定量PCR结果显示:实验组1和实验组2的A375细胞在转染后48h livin mRNA表达量分别下降了17%和42%,转染后72h livin mRNA表达量分别下降了71%和61%,48h到72h干扰片段的沉默效应呈增强趋势。(3)流式细胞术结果显示:转染后48h A375细胞凋亡率:实验组1和实验组2(31.00±2.25%和34.72±1.29%)高于空白组(3.21±2.10%)(P＜0.05),脂质体组和阴性对照组(7.67±1.34%和6.84±1.34%)与空白组相比无差异(P＞0.05);转染后72h A375细胞凋亡率:实验组1和实验组2(34.90±1.71%和38.59±1.31%)高于空白组(3.87±3.04%)(P＜0.05),阴性对照组和脂质体转染组(7.44±1.69%和7.89±1.44)与空白组相比无差异(P＞0.05)。(4)PI单染流式细胞术结果显示:转染后48h,shRNA-2可引起G_0/G_1期细胞数升高,S期细胞数下降,siRNA-1作用不明显,转然后72h shRNA-1、2均能引起引起G_0/G_1期细胞数升高,S期细胞数下降。结论:(1)设计出针对livin共有序列的发卡样shRNA寡核苷酸片段。(2)成功构建出针对livin的shRNA表达载体pGPU6-GFP-livin-shRNA-1、pGPU6-GFP-livin-shRNA-2。(3)shRNA-1和2均能减少A375细胞中livin mRNA的表达。(4)shRNA-1和2均能促进A375细胞凋亡。(5)shRNA-1和2均能使A375细胞周期出现G_0/G_1期阻滞,细胞增殖受到抑制,但调控细胞周期的作用时间点不同。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R739.5
【图文】：

图2.4.2pGPU6一即一shRNA载体的构建图谱Figure2.4.2PGPU6{FP一shRNAveetormaP2.4.2所示:pGpU6一GFp载体共有5117饰，BamHx位于第1663位碱基，万bsl位于第172BamHI/Bbsl双酶切后，在T4DNA连接酶的作用下，shR到A寡核昔酸模板连接于pGPu载体。重组体的转化取8衅的稀释后连接体系与100贝己制备的感受态细胞TMIOg，轻旋混匀，冰in，45oC热冲击1.smin，然后快速置于冰上lmin，加800林1sOC培养基混匀，震荡培养lh，400Orpm室温下离心smin，弃上清约800贝后余液与细菌吹打00川涂布在含卡那霉素的LB平板上。将培养基于37℃培养箱放置lh后待菌液倒置平皿，培养过夜。重组体的筛选

毕业论文shRNA沉默livin基因对人恶性黑结果体的酶切鉴定GFP共有5117bp，BamHl位于1663bp，BbslsllRNA编码区取代)，所得质粒用BamHl，Bb、BamHl和Bbsl切开，而不能被Pstl切开(图123M45

图2.1pGPu6一GFP一hvin插入序列测序结果Figure2.1PGPU6一(;FP一livinsequeneinginsertionsequenee1工V立n1主v立n31即AtarqConsenSU3TCCCTCCATGGGACCTAA............……qaCagtgCcaagtgcCtqc图2.2pGpU6一GFp一livin插入序列BLAsTL匕对结果Figure2.2pGpU6一GFp一livininsertionsequeneeonBLASTresults2.2显示sllRNA的靶序列通过BLAST与Genbank记录的人livin一cDNA序列比较，结果一细胞转染组质粒转染A375细胞，荧光显微镜下观察如图3.1

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本文编号：2751931