皮肤鳞状细胞癌与基底细胞癌9号染色体杂合性丢失及PTCH1表达的研究

发布时间：2020-07-14 00:53

【摘要】： 目的皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和基底细胞癌(basal cellcarcinoma,BCC)的发生是多因素、多阶段、多基因共同作用所致,涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的失活。用DNA多态性标记肿瘤染色体特定位点,分析其杂合性丢失(loSS of heterozygosity,LOH)已广泛用于抑癌基因(tumor suppressorgene,TSG)的筛选和机制的研究。SCC与BCC有着不同的生物学行为和病理学特征,提示这两种肿瘤的发生机制不尽相同,因此探讨SCC与BCC相关基因及其表达产物可以为临床诊疗提供标记物。PTCH1(human homolog of the Drosophila pathed1,PTCH1)为TSG表达的一种蛋白,在多种肿瘤发生的Hedgehog信号传导通路中发挥重要作用;因此有必要探讨其在SCC、BCC表达情况,为SCC、BCC的诊断和治疗提供可能的分子靶标。近来LOH研究显示染色体9p21-22和9q22-23缺失频率较高,提示9p21-22和9q22-23内可能存在与SCC、BCC发生有关的抑癌基因。为证实SCC、BCC与9号染色体杂合性丢失的相关性,本研究利用激光捕获显微切割(laser capturemicrodissection,LCM)技术特异性捕获肿瘤细胞,将其PCR扩增产物与外周血DNA的PCR产物对比进行LOH分析。本研究选择了5个微卫星多态性标记,3个位于9p21-22区域,2个位于9q22-23区域,分析26例BCC和10例SCC的LOH缺失情况,以期确定其是否与肿瘤发生有关。并进一步应用免疫组化技术分析PTCH1蛋白在SCC及BCC中的表达情况及意义。方法 LOH样本:26例BCC,10例SCC新鲜组织标本,OCT包埋,-80℃保存备用,诊断均经病理证实。显微切割特异性捕获肿瘤细胞:7μm连续冷冻切片,采用SLμCut显微分离系统捕获肿瘤细胞约4000个。肿瘤细胞DNA的提取与PCR扩增:肿瘤细胞DNA的提取参照QIAamp DNA Mini Kit试剂盒说明书,对目的基因进行PCR扩增。微卫星多态性标记的选择参考文献报道,从UCSC人类基因组数据库获得微卫星序列。LOH分析:取10μlPCR产物与10μl甲酰胺上样缓冲液混合,95℃变性10min,冰冷5分钟。加样10μl于8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(含7M尿素),80v电泳2.5h,硝酸银染色,观察等位片段大小和信号强度,判断结果。与正常组织相比,癌组织条带消失或相对密度减少50%以上时判断为LOH。若癌组织条带增多或位移则判断为微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)。免疫组织化学:标本8例BCC,26例SCC,5例正常皮肤石蜡包埋,5μm连续切片,PTCH1抗体购自北京奥维亚生物技术公司,稀释浓度为1:200,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木苏复染,胞内见均一的棕黄色颗粒为阳性。400倍镜下计数5个视野或者1000个细胞,计算阳性细胞所占的百分数,染色细胞≥20%为阳性,实验数据经过SPSS13.0进行x~2验检分析。P0.05为差异有统计学意义。结果一、26例BCC的5个位点中,D9S196 LOH频率为11.5%(3/26),D9S916为7.7%(2/26),D9S974MSI为15.4%(4/26),D9S1814LOH的频率为最高15.4%(4/26),D9S176未发现LOH及MSI. 二、10例SCC杂合性丢失研究显示:D9S974 MSI为10%(1/10),D9S176、D9S1814、D9S196及D9S916均未见LOH及MSI。三、免疫组化染色:5例正常皮肤阳性率为20%(1/5),8例BCC均为阳性100%,28例SCC阳性率为92.3%(24/26)。结论一、在BCC中,与D9S1814连锁的P15基因,D9S974连锁的P16基因,可能与BCC的发生相关。二、PTCH1基因内D9S176及D9S196两个微卫星多态性标记的LOH频率明显低于国外,推测其在SCC、BCC的发生中可能存在种族差异。三、BCC与SCC在9号染色体发生LOH位点不同,两者机制不同。四、SCC、BCC与正常皮肤相LLPTCH1蛋白高表达,均有统计学意义(P0.05),SCC与BCC之间无统计学差异(P0.05)。PTCH1高表达可通过激活Hedgehog信号通路在SCC、BCC发生过程起重要作用。五、不同病理分期的SCC中PTCH1蛋白表达无统计学差异(P0.05)。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R739.5
【图文】：

琼脂糖电泳,引物,个体数,微卫星不稳定

M1MZM3M4MSMarker图2，琼脂糖电泳结果(PCR扩增引物分别为MI，DgSg16;MZ，D959M3，DgS176;M4，DgS1814;MS，Dgsl96)二)杂合性丢失及微卫星不稳定检测结果28例BCC的5个位点中，DgS196的[JOH频率为14.3%(4/28)，DgSgl1%(2/28)，DgS974MSI为11.1%(3/27)，Dgslsl4LOH的频率为最高14.3%(4/2S176未发现LOH及MSI。10例SCC等位基因不平衡研究显示:DgS176MSI为10%(l/10)，DgSgl6的10%(l/10)，D95974MSI为20%(2/10)。D951814及Dgsl96均未见LO于l及M表3，BCC和SCCLOH及MSI发生率位点BCCSCCLOHMSI信息个体数LO卜I%MSI%LOHMSI信息个体数LOH%MS17600260000100

正常皮肤,阴性,片段,正常组织

LOH一 DgS196(片段缺失)LOH一 DgS1814(染色减弱)LOH一 DgSg16(片段缺失)MSI一D95974(片段增加)图3一3变性聚丙烯酸胺凝胶电泳结果(T:BCC肿瘤组织;N:正常组织)二、免疫组化PTCHI在病变组织及临近表皮均成强阳性表达，阳性染色定位与胞浆。正常

鳞癌,胞浆内,异形,癌细胞

PTCHI在111级鳞癌胞浆内成强阳性表达，并见大量核异形和核分裂相(X4OO)

【参考文献】