体外甲真菌病模型的建立及甲板内外氟康唑药敏实验结果的比较

发布时间：2020-08-08 13:41

【摘要】： 目的：真菌病是一种常见的皮肤科疾病，虽然对其发病机制已基本明了，但治疗较困难，用药以口服药物为主，耗时长，花费大。这就要求医师在选择用药时必须有针对性。目前临床上应用较广泛的药物筛选实验是通过体外药基法测定药物的MIC值，但因这种方法受体外环境如温度、湿度和培养基种类等因素影响较大，所以各家试验结果不一。而且体外试验条件与体内药物实际作用环境不同，不能确切反映药物在体内的抗真菌效能大小，如何考察药物在甲板内的抗真菌活性成了一个急待解决的问题。本实验正是从这一问题着手展开研究，目的有二个，一是经人工手段破坏离体甲板，再在甲板上种植真菌，最终经甲板病理切片证实有真菌的侵入，从而创建体外甲真菌病的模型。二是用不同浓度的氟康唑浸泡离体甲板，再借用上述方法人为地造成甲真菌病感染，根据甲板中有无菌丝、孢子结构，确定氟康唑在甲板内抑制真菌侵入的最低浓度，将此浓度值与体外药基法试验所测MIC值作对比，明确本试验与体外药基法试验结果有无显著性差异。材料和方法：首先建立体外的甲真菌病模型。随机剪取正常人外缘甲板用蒸馏水清洗去污后加入2.5%NaOH浸泡，经3-6小时甲板变软，从而破坏其致密的角质层结构。再用蒸馏水洗去甲板中残留的NaOH成份，避免碱性物质对真菌生长的影响。接下来，将甲板 WP=4 与马铃薯葡萄糖（PD）液体培养基共置于4支小试管中，高温高压灭菌，备用。挑取四种甲真菌病常见致病菌的菌落，包括皮肤癣菌属的红毛，白毛和酵母菌属的白念，克柔氏念珠菌，制成1-5×107cfu/ml的菌悬液。分别往4支小试管内接种四种菌悬液，置于温箱中25℃培养30天。取出甲板制备病理切片，并作PAS染色，镜检结果显示各甲板中均有真菌侵入。其次，在体外甲真菌病模型基础上做甲板内氟康唑药敏试验，与体外药基法试验所测结果作对比。仍循上述方法软化甲板。随后配制不同浓度的10%二甲基亚砜（DMSO）氟康唑透甲液。共分成针对红毛、石毛、白念、克柔氏念珠菌的四组试管。根据体外药基法测得的氟康唑针对4种真菌MIC值（见附表1），每组又分为100倍MIC，10倍MIC，MIC三个浓度梯度，全部12支试管每支管内均加入3块甲板浸泡20天。取出甲板，放进盛有PD液体培养基的试管，将红毛、石毛、白念、克柔氏念珠菌的菌悬液，分组接种于试管中，培养30天后制备甲病理切片观察。只有每管3块甲板切片均未见真菌结构，方能判定该组菌种对该管浓度下氟康唑敏感。结果：在建立体外甲真菌病模型的试验中，各管均见明显菌落生长，镜下的切片中甲板角质层遭破坏，角质层内可见数目不等的菌丝孢子，形态与取自甲真菌病患者病甲的切片所见一致，证明离体甲板的甲真菌病致病模型成功建立。在测定甲板中氟康唑抗真菌活性的实验中，菌落生长较前减慢。作甲病理切片，只有石毛组100倍MIC浓 WP=5 度管内全部3块甲板均未见真菌结构，将此浓度值与体外药基法所测MIC值作一对比，前者远高于后者，经统计学分析，二者有显著性差异。结论：1.正常人离体甲板的致密结构被破坏后，在甲板上接种真菌，给予适宜的温度、营养等条件，就可以建立体外甲真菌病的感染模型。 2.体外药基法所测MIC值不能确切反映药物如氟康唑在甲板内的抑真菌作用大小，从此次实验结果看，要达到抑制真菌侵入甲板的作用，甲板内氟康唑浓度必须要高于体外所测MIC浓度。 3.当怀疑某一真菌为甲真菌病致病菌时，将此菌菌株接种到经软化处理的离体甲板上，根据甲板切片中是否有菌丝或孢子，可判定其是否为真正致病菌，这样就为发现新的致病菌开辟了一条新的检验途径。 4.遵循本实验思路，用不同浓度外用药浸泡甲板，之后接种真菌，由甲板切片观察真菌能否入甲，可用来论证外用药治疗甲真菌病的疗效和最佳浓度。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R756

【引证文献】