抗体芯片技术及其在肝癌和银屑病标志物研究中的应用

发布时间：2020-08-14 07:51

【摘要】：疾病早期诊断和有效治疗的关键之一是能否找到指示疾病发生和发展的标志物分子,如何寻找和发现有价值的生物标志物分子是精准医学发展的重要途径。血清和血浆含有丰富的生物信息,可反映人体生理和病理状况的变化,是理想的用于疾病生物标志物筛选的样本来源。抗体芯片技术具有高通量、高灵敏度的特点,适用于血清和血浆中低丰度蛋白质的检测,而数据独立采集质谱(Data-independent acquisition mass spectrometry,DIA-MS)技术对血液蛋白质组的检测具有很高的通量和覆盖率。本文首先运用抗体芯片技术对肝病血清样本进行检测,初步筛选出指示肝癌发生和发展的潜在生物标志物。然后通过结合抗体芯片技术和DIA-MS技术建立的深度血清蛋白质组学平台,探索银屑病发病期间蛋白质水平的变化及其与临床信息的关系。具体工作如下:1.本研究开展了基于高密度抗体芯片技术检测肝癌的血清蛋白质表达图谱和潜在生物标志物的工作。首先,运用由1000个血清蛋白质的抗体组成的抗体芯片以及生物素标记血清的策略对健康人和乙型肝炎、肝硬化、肝癌(AFP阴性)四组样本的血清蛋白表达图谱进行检测,并通过one-way ANOVA统计学方法分析差异蛋白。然后,用本实验室点制的小型芯片对检测的差异蛋白进行多重验证,发现甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)、癌胚抗原125(Carcinoembryonic antigen125,CA125)、Myc诱导核抗原(Myc-induced nuclear antigen,MINA)和D-二聚体(D-Dimer)在疾病组和健康组中有显著差异,其中MINA和D-Dimer分别与肝硬化和肝癌密切相关。表明该抗体芯片技术可用于肝癌血清蛋白表达图谱的检测,且具有很好的重复性和特异性。另外,生存曲线分析发现MINA和D-Dimer对于肝癌可能具有一定的预后价值。说明通过抗体芯片的方法可以初步筛选出具有临床诊断意义的肝癌血清标志物,为进一步开展临床验证实验奠定基础。2.本研究工作联合DIA-MS技术和可定制抗体芯片技术开发了一种深度血清蛋白质组学研究平台,对血清蛋白质组的检测范围可跨越10个数量级。通过对50例健康对照和中药银屑灵治疗前后银屑病患者血清样本的检测,在银屑病患者中鉴定了106种参与银屑病相关生物过程的差异表达蛋白质,如凝血、炎症、细胞凋亡和血管生成等信号通路。此外,无偏差聚类分析和主成分分析结果显示,其中的58种蛋白质能够完全区分健康对照和银屑病患者,12种蛋白质能够完全区分银屑灵治疗响应者和无响应者。为了进一步证明我们检测平台的临床效用,通过对血清蛋白质组、临床信息和银屑病严重程度指数进行相关性分析,发现银屑病皮损面积和严重程度指数(Psoriasis area and severity index,PASI)评分与弹性蛋白酶抑制剂(Elafin,PI3)、C-C趋化因子22(C-C motif chemokine22,CCL22)和白细胞介素12B(Interleukin-12 subunit beta,IL12B)三种血清蛋白呈正相关。研究结果证明,我们的深度血清蛋白质组学平台可以用于银屑病及其他疾病早期诊断和个体化用药生物标志物的筛选,具有广阔的临床应用前景。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R735.7;R758.63;O657
【图文】：

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有低侵袭性、简单快速和低成本等优点，是理想的用于筛选疾病诊断和治疗生物逡逑标志物分子的样本来源。然而血液中不仅包含浓度达ｍｇ／ｍｌ的高丰度蛋白，还包含逡逑浓度在ｐｇ／ｍｌ以下的低丰度蛋白（图１．１）邋ｉ８ｉ，在检测中，低丰度蛋白的信号很容易逡逑被高丰度蛋白掩盖，据报道只有约５°／。的肿瘤组织蛋白可以在血浆中被检测到１９】，逡逑因此如何实现对血液蛋白质组检测范围的高度覆盖，同时定量检测血液中的低丰逡逑度蛋白面临着巨大的挑战。逡逑ＩｇＧ逡逑转铁蛋白逡逑赢逦ＩｇＡ逦脂蛋白ａ逡逑／ｄ逦＾１＾（４逦ａｌ酸性糖蛋白逡逑，二＿邋Ｖ逦佭如八１逡逑鲁．ｉ逦＾ｃｉｑ逡逑Ｉ逦？ｉ00／？其它逦ｓ逡逑白蛋白逦ｖ：：：ｆ逦血删蓝焌逡逑围子逡逑图１．１邋２２种人血浆高丰度蛋白逡逑１．１血液蛋白质组学研究背景逡逑２００２年安德森最早提出了血浆蛋白大纲１５］，文章列出了血液中的２８９种蛋白质，逡逑并描绘了正常血浆中丰度超过１０个数量级的血浆蛋白，并将其大致分为经典血浆逡逑蛋白、组织间隙产物、细胞因子以及其他低丰度蛋白。２００３年，人类血浆蛋白质逡逑组计划（Ｈｕｍａｎ邋Ｐｌａｓｍａ邋Ｐｒｏｔｅｏｍｅ邋Ｐｒｏｊｅｃｔ，ＨＰＰＰ）通过在３５个不同的实验室中对高逡逑加索人、非洲裔美国人和亚裔美国人的一系列血清和血浆样本进行质谱分析

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１．２血液蛋白质组学技术逡逑由于血浆蛋白的成分复杂、蛋白浓度动态范围广泛，而且存在很多高丰度蛋逡逑白，因此对血浆蛋白进行分析的技术面临挑战。如图１．２所示，目前血浆蛋白分析逡逑的基本策略主要分为三种：去除高丰度蛋白、对血浆蛋白／肽段进行预分离以及对逡逑血浆中某些组分的蛋白／肽段进行富集，除此之外，还有针对血浆中多肽和自身抗逡逑体的检测方法。逡逑抗体ＩＨ免疫蛋白质组分折、蛋白质芯片逡逑订邋逦邋逦逡逑「血團邋Ｉ逦團多肽丨一［ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ｉ逡逑（Ｉ逡逑血浆去除高半度逍勺Ｉ一邋ｆ蛋白富集Ｉ邋一邋Ｉ＂蛋白预分离逡逑抗体芯片｜逦｜肽段预分离Ｉ—肽段富集切为肽段逡逑质谱检测逡逑图１．２血浆蛋白质组研究常见的研究策略逡逑１．２．１基于质谱的血液蛋白质组学研宄逡逑质谱技术因其高通量、高灵敏度等特点己经成为目前蛋白质组研究的主要技逡逑术［２５］。基于质谱的蛋白质组实验及分析流程如图丨．３所示。（１）实验设计：生物逡逑样本制备、蛋白质的提取、分离与酶解、肽段分离及质谱分析等；（２）数据分析：逡逑包含质谱数据分析及对质谱定量结果的统计与生物学分析；（３）质谱数据分析：逡逑质谱的鉴定与质控、肽段与蛋白质的定量分析；（４）统计学与生物学分析：依据逡逑实验设计的区别选用合适的统计方法确定实验组别间的差异表达蛋白质逡逑（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＤＥＰｓ）、依据差异表达蛋白质进行功能富集等逡逑生物学分析及可视化。逡逑质谱技术起源于２０世纪５０年代的Ｅｄｍａｎ降解蛋白质测序技术，０前我们熟知逡逑的多维液相色谱－离子阱串联质谱技术（也称鸟枪法蛋白质组学

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