Notch1和VEGF在皮肤黑色素瘤中的表达及其临床意义

发布时间：2020-08-29 11:09

　　研究背景及目的黑色素瘤(melanoma)是一种起源于外胚叶神经嵴黑素细胞的高度恶性的肿瘤,在所有恶性肿瘤中约占1.5%,四肢、皮肤、肛门、外阴是发生率较高的部位。我国黑色素瘤发生部位以皮肤最为常见,其次为黏膜来源,其他部位相对少见。皮肤黑色素瘤(cutaneous melanoma,CM)是源于表皮正常黑素细胞或原有痣细胞的一种恶性程度极高的肿瘤,早期易发生局部淋巴结的转移,晚期可通过血流途径转移至远处皮肤、肝、脑及肺等,对放化疗均不敏感,预后差。由于皮肤恶性黑色瘤的预后差,高发病率和死亡率,严重影响人类的健康和生存质量。临床实验研究证实黑色素瘤的发生、发展涉及多种分子和信号传导途径参与的复杂病理机制,并有环境因素参与其中。研究皮肤黑色素瘤的相关发病因素和具体机制,将为其临床诊治提供可靠的理论依据。Notch基因因1919年在果蝇体内发现该基因的部分功能缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺口(notch)而得名,Notch信号传导通路由4种Notch基因受体(Notchl,2,3,4)、5种配体(DLL1、DLL3、DLL4、JAG1、JAG2)和CSL(一类DNA结合蛋白)组成。当Notch配体和相邻细胞的受体结合后,蛋白酶体切割Notch基因并释放具有核定位信号的胞质区(intracellular domain of Notch,ICN),随后进入细胞核内与CLS(一类DNA结合蛋白)结合,从而调节基因表达。近年的研究发现,Notch信号通路改变与代谢性疾病、内分泌疾病、遗传性疾病以及肿瘤(包括黑色素瘤)等多种疾病的发生发展有密切关系。肿瘤血管新生因可以满足肿瘤生长的代谢需要并为远处转移提供血管通路,被认为参与肿瘤的进展、侵袭和转移,并且通常被接受为肿瘤预后的指标,VEGF及其受体VEGFR被公认是血管新生过程中最有特征性和代表性的调节信号,通过多个信号通路调控血管基底膜分解及足体环的形成、促进内皮细胞增殖和迁移、参与血管网络的形成与成熟重构等一系列复杂的血管生成过程发挥作用。微血管密度(MVD)是定量衡量肿瘤中血管生成程度的指标,作为侵袭性肿瘤生长和转移的真实预测因子影响患者的生存,用CD34单克隆抗体标记可以准确预测微血管数。Notch1和VEGF之间可能存在单向信号调控或环状调控通路,协调促进黑色素瘤的血管生成。可能机制为:VEGF激活VEGFR1、VEGFR2后,通过下游PI3K/Akt信号级联通路,上调Notch1和Dll4的表达;而Dll4/Notch可能通过HSER1(HEY1)调节内皮细胞膜上的VEGFR2受体数量来负反馈调节VEGF信号通路。另外,有报告指出缺氧可上调Notch1的表达,Notch1基因与缺氧诱导因子1α(IF-1α)基因(一种在缺氧期间稳定的转录因子)簇合,该转录因子激活了几种VEGF等几种血管生成基因。但是,二者具体机制仍未阐明。Notch1和VEGF在黑色素瘤的发生发展中具有协同作用,在一定程度上提示黑色素瘤的生物学行为,可能为黑色素瘤的不良预后因子。目前,已有多项关于Notch1及Notch信号通路与皮肤黑色素瘤关系的研究,但是,人们对于皮肤黑色素瘤中Notch1的作用观点并不一致,仍需进一步探讨和明确。另外,关于Notch1和VEGF在黑色素瘤中的表达相关性及与血管新生的关系报道相对较少。本研究拟通过检测Notch1、VEGF及MVD计数在皮肤黑色素瘤和皮内痣中的表达,旨在明确Notch1与VEGF、MVD计数在皮肤黑色素瘤组织中的相关性及其与临床病理特征关系,探讨其在黑色素瘤临床治疗中的意义。方法1.采用免疫组化SP方法分别检测Notch1、VEGF在78例CM组织、40例皮内痣组织中的表达以及CD34标记的MVD(CD34-MVD)计数情况;2.应用SPSS19.0软件进行统计学分析,认为P0.05具有统计学意义。采用χ~2检验分析Notch1、VEGF在CM和皮内痣中的表达差异;采用独立样本的T检验分析CD34-MVD计数在CM和皮内痣中的表达差异;采用2×2配对资料的关联性分析分析CM组织中Notch1和VEGF表达的相关性;采用Spearman相关性分析分析CM中Notch1的表达和和CD34-MVD计数的相关性;3.应用Spearman相关分析分别分析Notch1、VEGF、CD34-MVD计数情况与CM临床病理特征的关系。结果1.皮肤黑色素瘤、皮内痣中Notch1、VEGF的表达和CD34-MVD计数情况及差异性分析Notch1以细胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒样物质为表达阳性,也可少量表达于黑色素瘤组织细胞核中;VEGF表达于黑色素瘤细胞和少数血管内皮细胞的细胞质,以胞浆或细胞膜内出现均匀棕黄色颗粒为阳性细胞;CD34多见于癌组织与周围组织边缘浸润区域,主要着色于血管内皮细胞的胞浆,在肿瘤组织的微血管中表达较强,在皮内痣组织也有阳性表达。Notch1在黑色素瘤、皮内痣中表达的阳性率分别为84.6%(66/78)、27.5%(11/40),χ~2检验显示差异有统计学意义(p0.05);VEGF在黑色素瘤、皮内痣中表达的阳性率分别为69.2%(54/78)、40.0%(16/40),差异有统计学意义(p0.05);CD34-MVD计数在黑色素瘤和皮内痣中表达分别为32.10±8.97、13.05±6.66,独立样本的T检验显示CD34-MVD在黑色素瘤和皮内痣中的表达差异同样具有统计学意义(p0.05)2.皮肤黑色素瘤组织中Notch1的表达和VEGF、CD34-MVD计数的相关性分析2×2配对资料的关联性分析表明Notch1和VEGF表达具有相关性(r=0.283,p=0.012);Spearman相关性分析表明Notch1和CD34-MVD计数相关(r=0.495,p=0.000)。Notch1的表达与两者均为正相关。3.Notch1、VEGF和CD34-MVD与黑色素瘤临床病理因素的关系Spearman相关性分析显示与ClarkI~Ⅱ级黑色素瘤患者相比,Notch1在ClarkⅢ~Ⅳ级黑色素瘤患者中Notch1阳性表达率显著升高(89.1%vs 35.7%,χ2=5.417,p0.05),差异具有统计学意义;在淋巴结转移特征中,Notch1阳性表达率在转移组较原位组升高(92.2%vs 70.4%,χ2=6.437,p0.05),差异具有统计学意义。同样的,VEGF和CD34-MVD在ClarkⅢ~Ⅳ级、淋巴结转移组和ClarkI~Ⅱ级、原位组比较有更高表达率和微血管密度,差异同样具有统计学意义(p0.05)。统计分析显示Notch1、VEGF和CD34-MVD在性别、年龄、肿瘤部位及直径方面虽有差异性表达,却均无统计学意义(p0.05)。结论1.Notch1可能与皮肤黑色素瘤的发生发展和转移有关;2.在Notch1和VEGF之间可能存在单向信号调控或环状调控通路,从而在黑色素瘤血管新生中共同发挥重要作用;3.活化的Notch1抑制剂可通过阻断肿瘤相关的血管形成来提供治疗黑色素瘤的策略。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.5
【部分图文】：

皮内痣,阴性,黑色素瘤

图 1 Notch1、VEGF在皮肤黑色素瘤、皮内痣中的表达（SP×400）Fig1 The expression of Notch1,VEGF in CM and Intradermal nevus(SP×400）注：ⅠA、ⅠB、ⅠC 分别是 Notch1在 CM组织中的阴性表达、弱阳性表达、阳性表达；ⅡA、ⅡB、ⅡC分别是 VEGF在 CM织中的阴性表达、弱阳性表达、阳性表达；ⅢA、ⅢB、ⅢC分别是 Notch1在皮内痣组织中的阴性表达、弱阳性表达、阳性表达；ⅣA、ⅣB、ⅣC分别是 VEGF 在皮内痣组织中的阴性表达、弱阳性表达、阳性表达；ⅤA、ⅤB分别是 CD34-MVD在 CM 和皮内痣中表达。表 1 Notch1、VEGF和 CD34-MVD在皮肤黑色素瘤、皮内痣中的表达率比较[例(%)]Tab 1 Differential expression of Notch1,VEGF and CD31 in CM and intradermal nevus分组例数 Notch1 VEGF CD34-MVD黑色素瘤 78 66（84.6） 54（69.2） 32.10±8.97皮内痣 40 11（27.5） 16（40.0） 13.05±6.66 2值 38.042 9.362 —P 值 0.000 0.002 0.0002 皮肤黑色素瘤组织中 Notch1 和 VEGF 表达、CD34-MVD 计数的相关性分析2×2 配对资料的关联性分析表明黑色素瘤组织中 Notch1 和 VEGF 表达呈正相

信号通路,作用机制

皮肤黑色素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤，肿瘤细胞浸润和重要脏器的转是造成死亡的主要原因。黑色素瘤的发生发展涉及多种分子和信号传导途径复杂病理机制，并有环境因素参与其中。相关信号通路关键分子的基因突变达是研究的重点。阐明 CM 发生的分子机制对于现有的治疗措施是非常必要Notch 信号通路的异常可以致使机体功能调节紊乱，导致肿瘤的发生。在otch 信号通路中，配体与受体的结合可导致受体构象改变，胞外域（ECN）的坏死因子-α-转化酶（TACE）金属蛋白酶切割位点暴露，在 TACE作用下发生，配体表达细胞吞噬切割后的 Notch胞外段游离的 N 端裂解片段，在 γ-分泌酶γ-secretase）的作用下进一步剪切受体细胞胞内的 C 端裂解片段，释放出α受化形式（NCID/ICN）并游离于胞质中，活化的 NCID转移至细胞核内，与转B 抑制因子 RPB-JK（也称 CSL/CB-F1）和共活化物 Co-A（MAML、组蛋白乙转移酶 P300/CBP）结合后，成为转录活化因子，进而活化 Hes1等分化拮抗基招募转录共抑制因子如 Groucho/TLE等，阻碍细胞特异性分化效应基因的表响细胞的分化、增殖和凋亡[32]。 Hes1是一种转录抑制因子，是 Notch1的下基因，可维持细胞未分化状态以保持足够的增殖细胞数目[33]。具体机制见

信号通路,配体,跨膜蛋白,端区

23图 3 Notch 信号通路受体结构域的差异[8]Figure1 Differences in receptor domains of Notch signaling pathway人的 Notch 同源配体有 Delta 样配体(Dll1、Dll3、Dll4)和 Serrate 样配体(Jagged1、Jagged2)[9]，也属于 I 型单次跨膜蛋白，包含细胞外和细胞内结构域。胞外域包括一个保守的 N 端区域、一个富含半胱氨酸的 DSL 区域(Delta,Serratea

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