小鼠皮肤特异性敲除Ppp2ca基因对毛发生长的影响
发布时间：2020-09-04 17:36
背景和目的：蛋白质的磷酸化与去磷酸化在细胞的生命活动中起着重要的作用。蛋白磷酸酶2A (PP2A)是生物体内主要的丝/苏氨酸磷酸酶,参与了细胞代谢、DNA复制、细胞周期和细胞分化等生命活动。研究显示,PP2A也参与了皮肤细胞的增殖分化和创伤愈合。本研究拟通过在皮肤角质细胞中特异性敲除PP2A蛋白C亚基(Ppp2ca)基因构建小鼠模型,探索Ppp2ca在小鼠皮肤生长发育中的作用。 方法：将Kre14-Cre转基因工具鼠和Ppp2ca条件型敲除小鼠通过两代的交配,得到从胚胎期14.5天开始在角质细胞中缺失Ppp2ca基因的小鼠。通过对不同时期小鼠皮肤组织的Western、皮肤组织切片、免疫组化等实验,分析缺失Ppp2ca对小鼠皮肤生长发育的影响。 结果：首先获得了基因型为Ppp2cαflox/flox; Krt14-Cre的小鼠,并通过皮肤基因组PCR鉴定及Western Blotting等方法验证了Ppp2ca基因在这种突变小鼠皮肤组织中的表达降低。在皮肤角质形成细胞中特异性敲除Ppp2ca,敲除鼠体重明显变小、毛发稀少并且脚掌出现色素沉着,30%敲除鼠在出生后6W内死亡；对出生后P5(follicular morphogenesis)、P11(anagen)、P17(catagen)、 P24(telogen)以及P32(anagen)天小鼠皮肤组织进行形态学观察发现,敲除鼠在出生后第一个毛发生长周期毛囊形态发育异常,毛囊排列紊乱,不能正常下沉到脂肪细胞层,导致毛发生长受阻滞。皮肤毛囊分化标志性蛋白AE13与AE15在敲除鼠中表达下降,表明敲除鼠毛干皮层角蛋白表达量减少,毛囊髓质和IRS层的毛透明蛋白表达减少,提示毛囊分化异常。 结论：本研究证实了在皮肤角质形成细胞中敲除Ppp2ca基因会导致小鼠发育受阻,体型变小,脚掌出现色素沉着,皮肤毛囊分化发育异常及小鼠皮肤毛发稀疏。推测Ppp2ca参与了皮肤毛囊分化信号通路,是皮肤生发所需基因。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：Q78;R751
【部分图文】：
^mi=322图2 ?Pp/jJca条件型敲除小鼠构建示意图。A: Ppp2ca含有309AA氨基酸序列。催化亚基C (淡黄色区域）占23-305AA，本实验室敲除C亚基的35-105AA (深黄色区域）。B: Pppica载体构建示意图。C: Pppica引物鉴定示意图（其中1，2，3泳道的基因型分别为WT, Ppp2ca伽‘加,Ppp2ca''^°~', M 为 Marker)。为了验证Ppp2ca是否与皮肤生长发育密切相关，本实验使用Krtl4-Cre工具鼠阻断Ppp2ca在皮肤角质形成细胞中的表达。Krtl4-Cre转基因小鼠由人源的Krtl4启动子启动Cre重组酶的表达，表达始于小鼠胚胎期14.5天的表皮毛发和颈须毛囊细胞，成年小鼠的表皮和毛囊中也有强烈的Cre酶表达。部分Krtl4_Cre雌性小鼠卵母细胞中也有Cre酶表达，为了避免产生敲除的配子，所以不能用Krtl4-Cre雌鼠交配。将雄性的Krtl4-Cre小鼠与/?？““雌鼠交配
A: P/;p2a/""’&//ACre小鼠组织基因组PCR，1，2，3号泳道分别为胸腺，舌，皮肤组织基因组DNA。B: Ppp2ccf"、}0;Krtl4-Cre小鼠皮肤中Ppp2ca蛋白表达情况。C:不同基因小鼠皮肤cDNA的PCR电泳结果，1,2,3号泳道小鼠基因型分别为Ppp2ca?"to. f^,.fj4.Cre, Ppp2ca ""' ； KriN-Cre , WT, M 为 Maker。D: Ppp2ccJi'—、’ Krtl4-Cre小鼠与对照鼠皮肤切片免疫组化实验(400倍放大)。3、Pppica的缺失对小鼠生长发育的影响在成功得到实验所需基因型的小鼠后，我们发现这种小鼠体型均比同窝对照小（图4A)且表现为不同程度的毛发稀疏（图4B-C),出生后一周内小鼠脚掌出现肉眼可见的色素沉着（图4D)，敲除鼠尾巴变硬成竹节状（图4E-G),30%的小鼠在出生后4-6W内死亡。
本实验将处于毛囊分化不同时期的小鼠皮肤切片进行免疫组化染色，使用的抗体为AE13和AE15。结果发现敲除鼠AE13染色明显低于对照组（图6)。AE15染色在P5天时无明显变化，但是从P11天毛囊发育异常开始染色明显降低，在部分毛囊中甚至消失了（图7)。这些结果表明，敲除鼠角化的皮质层减少并且毛干髓质和IRS层分化异常。推测可能是由于IRS层和毛干髓质的分化受阻导致毛发生长周期被扰乱。Control Mutant? ?? % ‘ ~'z ^ \、\、D、■‘P"截、、：■”P17F'、“’图6毛发生长不同时期敲除鼠与对照壀皮肤的AE13免疫组化实验（褐色表示AE13阳性细胞）（200倍放大）32
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：Q78;R751
【部分图文】：
^mi=322图2 ?Pp/jJca条件型敲除小鼠构建示意图。A: Ppp2ca含有309AA氨基酸序列。催化亚基C (淡黄色区域）占23-305AA，本实验室敲除C亚基的35-105AA (深黄色区域）。B: Pppica载体构建示意图。C: Pppica引物鉴定示意图（其中1，2，3泳道的基因型分别为WT, Ppp2ca伽‘加,Ppp2ca''^°~', M 为 Marker)。为了验证Ppp2ca是否与皮肤生长发育密切相关，本实验使用Krtl4-Cre工具鼠阻断Ppp2ca在皮肤角质形成细胞中的表达。Krtl4-Cre转基因小鼠由人源的Krtl4启动子启动Cre重组酶的表达，表达始于小鼠胚胎期14.5天的表皮毛发和颈须毛囊细胞，成年小鼠的表皮和毛囊中也有强烈的Cre酶表达。部分Krtl4_Cre雌性小鼠卵母细胞中也有Cre酶表达，为了避免产生敲除的配子，所以不能用Krtl4-Cre雌鼠交配。将雄性的Krtl4-Cre小鼠与/?？““雌鼠交配
A: P/;p2a/""’&//ACre小鼠组织基因组PCR，1，2，3号泳道分别为胸腺，舌，皮肤组织基因组DNA。B: Ppp2ccf"、}0;Krtl4-Cre小鼠皮肤中Ppp2ca蛋白表达情况。C:不同基因小鼠皮肤cDNA的PCR电泳结果，1,2,3号泳道小鼠基因型分别为Ppp2ca?"to. f^,.fj4.Cre, Ppp2ca ""' ； KriN-Cre , WT, M 为 Maker。D: Ppp2ccJi'—、’ Krtl4-Cre小鼠与对照鼠皮肤切片免疫组化实验(400倍放大)。3、Pppica的缺失对小鼠生长发育的影响在成功得到实验所需基因型的小鼠后，我们发现这种小鼠体型均比同窝对照小（图4A)且表现为不同程度的毛发稀疏（图4B-C),出生后一周内小鼠脚掌出现肉眼可见的色素沉着（图4D)，敲除鼠尾巴变硬成竹节状（图4E-G),30%的小鼠在出生后4-6W内死亡。
本实验将处于毛囊分化不同时期的小鼠皮肤切片进行免疫组化染色，使用的抗体为AE13和AE15。结果发现敲除鼠AE13染色明显低于对照组（图6)。AE15染色在P5天时无明显变化，但是从P11天毛囊发育异常开始染色明显降低，在部分毛囊中甚至消失了（图7)。这些结果表明，敲除鼠角化的皮质层减少并且毛干髓质和IRS层分化异常。推测可能是由于IRS层和毛干髓质的分化受阻导致毛发生长周期被扰乱。Control Mutant? ?? % ‘ ~'z ^ \、\、D、■‘P"截、、：■”P17F'、“’图6毛发生长不同时期敲除鼠与对照壀皮肤的AE13免疫组化实验（褐色表示AE13阳性细胞）（200倍放大）32
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本文编号：2812393
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