rAAV2-TRAIL的构建及对恶性黑色素瘤细胞的凋亡作用

发布时间：2017-04-02 11:12

  本文关键词：rAAV2-TRAIL的构建及对恶性黑色素瘤细胞的凋亡作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 探讨腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)基因对恶性黑色素瘤细胞的凋亡作用。 方法 采用PCR方法，以TRAIL质粒为模板，扩增出编码sTRAIL的TRAIL胞外区片段，，将此TRAIL胞外区片段插入真核表达载体，构建出穿梭质粒pSNAV2.0-sTRAIL，利用细胞内质粒DNA同源重组法将扩增出的sTRAIL片段插入至腺相关病毒载体上，构建出携带有表达sTRAIL的重组腺相关病毒rAAV2-sTRAIL。将该病毒体外转染人恶性黑色素瘤细胞A375（实验组）及人胚肾细胞HEK293（对照组），ELISA、Western blot法检测目的基因在细胞中的表达，MTT法检测其对细胞增殖的影响，电镜下观察及流式细胞仪检测rAAV2-sTRAIL对A375的凋亡作用，分析其体外抗人恶性黑色素瘤细胞的机制。 结果 成功构建出病毒rAAV2-sTRAIL，PCR检测目的基因条带正确；Western blot方法可在细胞内检测出现明显TRAIL条带；转染48小时后ELISA法检测细胞培养液中TRAIL，HEK293培养基中浓度为190.6±24.1ng/ml，A375培养基中浓度为56.7±12.4ng/ml；MTT法见rAAV2-sTRAIL可对A375增殖有明显影响，而对HEK293无明显影响；电镜观察及流式细胞仪检测证实rAAV2-sTRAIL可诱导恶性黑色素瘤细胞A375凋亡。 结论 AAV2-sTRAIL可以在人正常细胞HEK293及恶性黑色素瘤细胞A375中高效表达并分泌到胞外，对恶性黑色素瘤细胞A375有明显的诱导凋亡作用，而对HEK293无明显影响。
【关键词】：腺相关病毒 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 人恶性黑色素瘤细胞人胚肾细胞 凋亡
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-9
• 第1章 引言9-13
• 第2章 AAV2-TRAIL 的构建及对恶性黑色素瘤细胞的凋亡作用13-27
• 2.1 材料13-14
• 2.1.1 试剂材料13
• 2.1.2 仪器及设备13-14
• 2.2 实验方法及步骤14-18
• 2.2.1 主要试剂和培养基配备方法14-15
• 2.2.2 rAAV2-sTRAIL 的构建、扩增、纯化及鉴定15-17
• 2.2.3 rAAV2-sTRAIL 的转染及目的基因的表达17
• 2.2.4 rAAV2-sTRAIL 在体外对细胞的凋亡诱导活性17-18
• 2.2.5 统计学处理18
• 2.3 结果18-24
• 2.3.1 rAAV2-sTRAIL 的构建、扩增、纯化及鉴定结果18-20
• 2.3.2 rAAV2-sTRAIL 的转染及目的基因的表达结果20-22
• 2.3.3 rAAV2-sTRAIL 对 A375 的凋亡诱导作用结果22-24
• 2.4 讨论24-27
• 第3章 结论27-28
• 致谢28-29
• 参考文献29-32
• 综述32-37
• 参考文献36-37

【参考文献】

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1 安丽娜;李著华;岳扬;王树人;郭志英;彭克军;韩晓群;;婴儿双歧杆菌介导的双自杀基因CD/UPRT对鼠黑色素瘤细胞的杀伤效应[J];华西药学杂志;2006年02期

2 胡立强;杨浩;万琳;卢晓风;;锌离子对sTRAIL分子聚合状态及肿瘤细胞杀伤活性的影响[J];生物医学工程学杂志;2013年02期

3 张建华;赵德矿;王青青;沈芬平;翁跃颂;;IL-12基因联合CD40L基因治疗小鼠黑色素瘤的实验研究[J];中国免疫学杂志;2007年05期

4 崔正军;岑瑛;张洁;;反义血管内皮细胞生长因子_(165)基因治疗皮肤恶性黑色素瘤的实验研究[J];中国修复重建外科杂志;2006年05期

  本文关键词：rAAV2-TRAIL的构建及对恶性黑色素瘤细胞的凋亡作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：282386