真皮干细胞（SKPs）对实验性银屑病皮肤模型的治疗作用研究

发布时间：2020-09-27 12:21

　　背景:银屑病作为一种慢性免疫相关的炎症性疾病,其病因病机不清,迄今尚无满意疗法。近年发现,干细胞具有免疫调剂作用,有望治愈银屑病。源于真皮的干细胞即皮肤前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)易于取材、来源丰富、无异源性干扰,可成为银屑病干细胞移植的重要来源。而目前关于SKPs对银屑病的治疗尚未见报道。目的:通过构建体外银屑病三维皮肤模型,移植SKPs至银屑病模型,应用组织学、分子生物学等方法观察银屑病模型移植前后皮肤组织细胞、炎症因子及基因表达的变化,以探讨SKPs对银屑病的治疗作用及机制,为进一步体内研究SKPs治疗银屑病提供实验依据。方法:1.构建体外银屑病三维皮肤模型:(1)SKPs、角质形成细胞(keratinocytes,KC)、成纤维细胞(fibroblasts,FBs)的分离和培养:取新生BALB/c小鼠,分离表皮和真皮,真皮分离的细胞培养SKPs、FBs;儿童包皮的表皮分离的细胞悬液培养KC。(2)正常三维皮肤模型的构建及鉴定:将获取的FBs与Ⅰ型鼠尾胶原混合建立三维皮肤真皮结构,然后在其表面接种KC,行气-液界面培养以构建正常三维皮肤模型。采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察皮肤结构和免疫组化染色显示表皮KC特异性抗体CK10及真皮FBs特异性抗体VIM表达情况。(3)银屑病三维皮肤模型的构建:在构建正常三维皮肤模型的KC培养基中加入肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)构建银屑病三维皮肤模型,HE染色观察银屑病三维皮肤组织病理学变化。2.SKPs治疗银屑病三维皮肤:(1)实验分组:将成功构建的三维皮肤随机分为4组:正常组、模型组、治疗组和对照组。(2)SKPs移植到银屑病三维皮肤:将红色荧光PKH26标记的SKPs移植到治疗组,对照组注射Hanks液。(3)标本收集:分别收集正常组、模型组造模第3、6、9、12天以及治疗组和对照组治疗后第3、6天的上清液。同时收集上述4组造模或治疗后6天的皮肤组织。HE染色观察皮肤组织病理学变化。(4)指标检测:采用ELISA法检测各组上清液中的IL-1、IL-12、IL-17浓度以及qPCR检测各组组织IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA表达水平。3.采用SPSS17.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,采用t检验。P0.05差异有统计学意义。采用Graphpad Prism 6软件分析数据绘图。结果:1.原代分离培养的KC和FBs在镜下为贴壁生长,KC呈铺路石样或卵石样形态,FBs呈多角形或菱形外观;SKPs为悬浮生长,呈圆形或球形克隆样细胞团,细胞球中央颜色较深,周围明亮。2.三维皮肤模型外观表现:(1)正常三维皮肤表现为白色半透明状,边缘整齐无卷曲;(2)银屑病三维皮肤呈乳白色不透明,边缘卷曲,较正常三维皮肤缩小变厚。3.三维皮肤模型病理组织学改变及鉴定:(1)HE染色下,正常三维皮肤由表皮层和真皮层组成,分界清楚;表皮层细胞排列较整齐、形态一致;真皮层由少量细胞和胶原构成,结构紧密。(2)银屑病三维皮肤表皮明显增厚。(3)免疫组化染色显示正常三维皮肤表皮细胞着棕黄色、表达CK10阳性即为KC;真皮层着深棕黄色、表达VIM阳性即为FBs,正常三维皮肤模型成功构建。4.SKPs移植到银屑病三维皮肤后其冰冻切片显示携带红色荧光的SKPs弥散分布于皮肤组织中,并在组织中存活良好。5.SKPs对银屑病三维皮肤的作用:(1)经SKPs移植治疗后治疗组三维皮肤表皮及棘层明显变薄;而对照组则改善不明显。(2)各组上清经ELISA检测后,模型组IL-1、IL-12、IL-17表达水平较正常组明显升高(P㩳0.05);但经SKPs移植后,IL-1、IL-12和IL-17表达水平较模型组及对照组均明显降低(P㩳0.05);对照组与模型组比较,IL-1、IL-12和IL-17水平降低不明显(P0.05)。(3)各组皮肤组织经基因检测后,模型组表达IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA水平较正常组显著升高(P㩳0.05);然而经SKPs移植后,治疗组IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA表达均较模型组和对照组明显降低(P㩳0.05);对照组与模型组比较,IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA水平无显著降低(P0.05)。结论:1.体外培养的KC、FBs可与Ⅰ型鼠尾胶原成功构建正常三维皮肤模型。2.在正常三维皮肤基础上,持续加入TNF-α和IFN-γ,可成功建立银屑病三维皮肤模型,为银屑病发病机制及治疗研究提供良好实验载体。3.将SKPs移植到银屑病三维皮肤,可减轻表皮厚度,降低炎症因子IL-1、IL-12、IL-17表达,从而起到缓解银屑病的作用。
【学位单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R758.63
【部分图文】：

细胞团,球形,铺路石,卵石

SKPs (×100) SKPs (×400)图 1 原代培养的 SKPs 悬浮生长，呈圆形或球形克隆样细胞团。re2 The cultured SKPs were in a suspended growth by a round or pelletized clonKC (×100) KC (×400)图 2 培养的 KC 贴壁生长，细胞呈铺路石样或卵石样形态。ure2 The cultured KC grew stick to cells wall in the culture medium with paving

形态图,细胞团,铺路石,球形

SKPs (×100) SKPs (×400)图 1 原代培养的 SKPs 悬浮生长，呈圆形或球形克隆样细胞团。re2 The cultured SKPs were in a suspended growth by a round or pelletized clon

多角形,皮肤,细胞,银屑病

FBs (×100) FBs (×400)图 3 原代培养的 FBs 贴壁生长，细胞呈长梭形及多角形。re3 The primary cultured FBs grew stick to cells wall in the culture medium witspindle or ploygan shape.外三维皮肤的外观、组织病理学及特性正常三维皮肤和银屑病三维皮肤外观正常三维皮肤肉眼表现正常三维皮肤构建初，皮肤模型均匀透明，边缘整齐无卷曲（图培养至第 7 天，皮肤模型整体缩小，呈白色半透明状，边缘整齐卷曲，皮肤较初期变厚（图 4B）。银屑病三维皮肤肉眼表现

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