通过靶向捕获测序和HaCaT细胞实验鉴定与AD相关的TMEM232基因

发布时间：2020-10-17 15:20

　　 研究背景特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一种多因素影响的慢性炎症性皮肤疾病,主要特征为皮肤干燥,严重瘙痒,红斑病变。目前发病机制尚未明确,免疫反应调节异常和表皮屏障缺陷在AD的发展中起着重要作用。近些年,越来越多的证据表明,一些新的易感基因与AD患者的表皮屏障功能与先天性和适应性免疫有关。本研究团队于2011年首次进行了中国汉族人AD全基因组关联分析(genome-wide association,GWAS)研究,发现了5q22.1区域是AD新的易感区域,通过对该区域进行功能学分析及生物信息学预测,提示该区域TMEM232基因可能是中国汉族人群AD的易感基因,通过免疫组织化学研究发现,在AD和正常组织中TMEM232的蛋白表达有所不同。研究目的本课题拟通过对5q22.1区域的单倍型分析和靶向捕获测序研究该区域的易感基因功能变异,并通过功能学实验来初步验证该基因与AD的关联。研究方法课题组共纳入3055名汉族AD患者以及4346名对照,利用前期GWAS数据和基因分型信息结果,提取4个单核苷酸多态性(SNP)和6个插入缺失(Insertion/deletion,Indel)变异数据,针对每个个体利用PHASE v 2.1软件进行该区域的单倍型构建,用SPSS 13.0软件通过卡方检验统计病例组和对照组之间单倍型频率差异,寻找与AD有关联的单倍型。随后我们把含有统计学意义最强的单倍型样本挑选出来,再从这些样本中筛选高频率(0.5%频率)单倍型且尽量筛选纯合子,当纯合子样本量少可以选择杂合子,另外再筛选2例不含此单倍型样本作为参照。接着我们对挑选出来的样本在BGISEQ-500测序平台进行高通量靶向区域捕获测序,以找出有意义的基因功能变异;最后进一步对发现的基因进行Ha Ca T细胞转染实验,我们将实验性Ha Ca T细胞等分为三组:用p CMV6-Entry-gene转染的细胞,用p CMV6-Entry(Vect)转染的细胞和不用DNA转染的细胞(Con)。然后通过免疫印迹测量Ha Ca T细胞中的基因的表达,MTS法评估细胞增殖。最后,用1.5m M Ca Cl2处理转染细胞,然后通过蛋白质印迹测量分化标志物INV和LOR探索其对细胞增生和分化的影响。研究结果本研究一共发现了60种单倍型,8种常见的单倍型分别为H1,H2,H11,H15,H25,H37,H59,H60(频率0.5%),其中H15单倍型(GA CTG CA TAGCTAAGTACA)与AD显著相关(P=2.72E-10,OR=0.14,95%CI=0.07-0.28),在病例中频率为0.13%,对照组中为0.95%,病例组频率明显低于对照组,差异有统计学意义;我们根据筛选原则挑出16个样本,其中只有1例H15纯合子,其他均为杂合子,通过对样本进行靶向测序分析未发现显著的突变位点,但进一步的统计检验表明在某些功能区域,仅有基因TMEM232与H15存在统计学显著性(P=7.33E-5,OR=0.33,95%CI=0.19-0.58)。在Ha Ca T细胞转染功能实验中发现在构建过表达载体p CMV6-Entry-TMEM232(TMEM232)质粒组的细胞活力比在质粒空载体p CMV6-Entry(Vect)组以及用无DNA转染(Con)组的细胞活力低(所有P0.05)。此外,我们发现在Ca2+刺激的条件下,与Vect和Con组相比,TMEM232抑制内披蛋白(Involucrin,INV)和兜甲蛋白(Loricrin,LOR)的表达(均P0.05)。研究结论本研究验证了H15单倍型与AD的相关性,揭示TMEM232基因可能在AD中发挥着重要作用。且TMEM232的过表达抑制Ha Ca T细胞的体外增殖和分化。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R758.2
【部分图文】：

2 5q22.1 区域 10 验证位点 LD 图ig 2 The LD diagram of ten variants in 5q22.1 region..5.6 Target Capture Sequencing二代测序.5.6.1 测序样本选择本次测序实验要求DNA浓度≥20ng/ul，体积40ul以上。我们参考目前提取NA样本质量，计划挑选阶段进入5q22.1区域内的常见的单倍型样本用于进一步(位点选择及单倍型构建见下面步骤)。样本筛选有以下几个步骤：首先，把各本的单倍体基因型列出来，优先选择出含最具有统计学意义的单倍型的样本次，我们从这些样本中筛选含单倍型频率较高的样本，以确保表示每个高频> 0.5％）单倍型都包括进去；第三，我们尽量筛选纯合子，当没有足够数量合子时，也可以选择部分杂合子。

图 4 TMEM232 在 HaCaT 中的表达情况Fig 4 The expression of TMEM232 in HaCaT cellsCon：HaCaT 细胞；Vect：用 pCMV6-Entry 转染的 HaCaT 细胞。与 Con 和 Vect 组相比，TMEM232组中 TMEM232 蛋白表达丰富，P <0.05。3.7.2 TMEM232基因过表达抑制细胞生长为了确定TMEM232的过表达是否影响HaCaT细胞的生长，我们进行了MTS测定实验以评估细胞增殖。通过比较细胞孵育2小时后，3组细胞在390nm处的吸光度来分析细胞活力。数据显示TMEM232组的细胞活力分别低于Con和Vect组（均P<0.05）（图5）。

TMEM232 在 HaCaT 中的表达情况 The expression of TMEM232 in HaCaT cellsHaCaT 细胞；Vect：用 pCMV6-Entry 转染的 HaCaT 细胞 TMEM232 蛋白表达丰富，P <0.05。 TMEM232基因过表达抑制细胞生长为了确定TMEM232的过表达是否影响HaCaT细验以评估细胞增殖。通过比较细胞孵育2小时后析细胞活力。数据显示TMEM232组的细胞活5）（图5）。
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 孙逸平;安家宾;戴澄清;江载芳;李驰;王忠仁;;结核病的发病与白细胞抗原单倍型关联[J];中日友好医院学报;1988年03期

2 李双双;张迎新;范成明;陈宇红;邓传良;胡赞民;;单倍型分析技术研究进展[J];生物工程学报;2018年06期

3 刘平;任维宾;杨瑛;陈晓鸣;杨子祥;;角倍蚜细胞色素氧化酶(CO Ⅰ)基因的多样性分析[J];生物资源;2018年01期

4 郭茂东;王群英;陈燕萍;滕卫军;马拥军;杨小云;韦炜;丁进;;IL-12B基因多态性及单倍型与克罗恩病的关系研究[J];浙江医学;2018年09期

5 宣泽义;曹艳红;吴柱月;黄明光;陈少梅;王凯悦;陈宏;雷初朝;;南宁市肉牛的Y染色体遗传多样性分析[J];中国牛业科学;2019年03期

6 张森;李辉;;单倍型在QTL检测中的应用研究[J];中国农业科学;2007年04期

7 夏小婷;邹勇;党瑞华;黄永震;蓝贤勇;陈宏;雷初朝;;关岭牛Y染色体遗传多样性与父系起源研究[J];中国牛业科学;2017年06期

8 薛敏;潘芹芹;缪扣荣;周小玉;赵星;樊甦;唐燕;汪承亚;;127个家系的HLA-A、B、DR单倍型分析[J];中国输血杂志;2006年01期

9 袁宝军,颉玉欣,邹吉敏,安新,李伟,张志欣;2型糖尿病家系人类白细胞抗原DRB1~*和DQB1~*单倍型分析[J];中华老年多器官疾病杂志;2004年03期

10 钱恩芳;吴文静;王磊;王小娟;刘杨;马泉;赵慧;李彩霞;黄江;江丽;;Y-STRs和Y-SNPs综合分析方法在父系家系调查中的应用[J];南京医科大学学报(自然科学版);2019年08期

相关博士学位论文 前9条

1 王雅美;小麦胚乳ADP-葡萄糖转运蛋白编码基因TaBT1的遗传效应和育种选择研究[D];中国农业科学院;2018年

2 史素琴;LGR4基因多态性和单倍型与女性峰值骨密度及肥胖表型核心家系的关联分析[D];郑州大学;2018年

3 钱亚屏;中国云南5个民族的遗传多样性研究[D];中国协和医科大学;1999年

4 朱文圣;基因型常有误差时单倍型分析的统计方法[D];东北师范大学;2006年

5 于扬;染色体5q31区Graves病易感基因的研究和中国汉族人单倍型域的构建[D];中国医科大学;2007年

6 苗丽丽;小麦蛋白激酶基因TaSnRK2.3/4单核苷酸多态性及其与农艺性状的关联分析[D];东北农业大学;2017年

7 樊庆灿;京海黄鸡部分重要经济性状的全基因组关联分析研究[D];扬州大学;2014年

8 林衡;玉米重要农艺性状和抗病性状的全基因组关联分析[D];中国农业科学院;2015年

9 张杰;杜洛克×二花脸F_2资源群体免疫相关性状全基因组关联分析及候选基因功能初步研究[D];华中农业大学;2017年

相关硕士学位论文 前9条

1 李致伟;基于选择信号和关联分析鉴定温带和热带玉米中优势单倍型和关联基因[D];中国农业科学院;2019年

2 郑洁;通过靶向捕获测序和HaCaT细胞实验鉴定与AD相关的TMEM232基因[D];安徽医科大学;2019年

3 王柳;引物限制合成测序分析PCR产物单倍型的研究[D];东南大学;2018年

4 潘荣芳;不同步合成焦测序分析单倍型的研究[D];东南大学;2017年

5 陈翠敏;应用微卫星多态位点对X连锁型视网膜色素变性疾病进行遗传连锁分析的研究[D];第三军医大学;2006年

6 高敏;全基因组扫描定位遗传性对称性色素异常症易感区域[D];安徽医科大学;2003年

7 黄毅;鹅黑素皮质素受体-4基因（MC4R）单核苷酸多态性分析与生产性状相关研究[D];四川农业大学;2009年

8 赵丽;华西蟾蜍种群遗传多样性研究[D];西华师范大学;2017年

9 汪琦;牦牛四个低氧适应基因的遗传多态性研究[D];西南民族大学;2017年

本文编号：2844966